hsya对mscs向神经元样细胞分化的保护作用

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1、HSYA对MSCs向神经元样细胞分化的保护作用河北北方学院基础医学院河北张家口075000项目来源：河北北方学院重大项目(项目编号：ZD120177)o作者简介：宋小青(1978-),女，硕士，讲师，主要研究方向为细胞牛物学通讯作者：魏会平(1966-),女，学士，教授，主要研究方向为牛物学。摘要：探讨在MSCs向神经元样细胞分化过程中，A(HSYA)能否提高BME引起的细胞毒理作用的能力及HSYA的最佳保护剂量。MSCs贴壁后分7组处理，再进行活力检测，凋亡检测，各组细胞的SOD和GSH比活力或相对含

2、量检测，NSE、MAP-2及其基因的表达检测。实验结果表明HSYA能显著提高细胞的相对活力、降低细胞凋亡率、并能维持细胞内较高的SOD/GSH水平，该组各测试数据均可达到Control-1的80%以上;与Control-2相比,经120mg/LHSYA保护后，分化后的神经元样细胞存活时间明显延长，NSE和MAP・2呈阳性表达，RT-PCR结果表明在3-7h内NSE和MAP-2的mRNA相对含量一肓呈上升趋势。关键词：羟基红花黄色素，间充质干细胞，β■疏基乙醇【中图分类号】R329【文献标识码】

3、A【文章编号】1001-5213(2016)09-0220-01MSCs可分化为心肌细胞⑴、成骨细胞［2・3］、神经元样细胞［4・5］等；同时由于其取材方便、组织来源广且无显著的免疫原性［6］,己被看作是修复受损组织的“种子”细胞。木研究将初探HSYA能否提高细胞抵抗BME引起的细胞毒害作用的能力及最佳保护剂量，具体见下。1实验材料1.1动物3-4周SD雄性大鼠，购于河北北方学院动物室。1.2药品与试剂L—DMEM、胎牛血清及胰蛋白酶、HSYA、β■疏基乙醇、bFGF、NGF、NSE、MAP-

4、2及DAB试剂盒。1.3主要仪器安全工作柜、C02细胞培养箱、流式细胞仪、分光光度计、酶标仪、倒置荧光显微镜、低温离心机、凝胶成像系统等。2实验方法2.1MSCs的培养及鉴定无菌条件下，分离大鼠股骨，D-Hanks液冲洗后剪开股骨两端，注射器吸取约5mL的基本培养基冲洗骨髓腔，反复吹打后种植于25cm2的一次性培养瓶，置于37°C的恒温培养箱中培养。于第3d首次换液，以后每隔2-3d换液1次，直至细胞融合达85%以上，用0.25%的胰酶消化后进行传代。培养至第3代时，经胰酶消化制成MSCs单细胞悬液并计

5、数，利用D-Hanks(不含Ca2+、Mg2+)洗涤3次，然后分别加入10μl的CD29-PE,CD34-FITC,CD45-FITC和CD90・APC兔抗鼠单克隆抗体混匀，再用D-Hanks洗涤后经流式细胞仪进行检测分析。2.2细胞活力及凋亡检测取3thMSCs,贴壁后分7组处理：Control-1连续用基本培养基培养，Control-2先用基本培养基培养后，然后用预诱导培养基培养24h；5个HSYA保护组先用保护培养基培养24h,然后用预诱导培养基培养24h；处理完毕后每孔加20μlMT

6、T溶液(5mg/ml),放入培养箱孵育4h后弃上清，每孔加入150μl的DMSO,室温震荡10min后放入酶标仪，在570nm波长处测OD值。取3thMSCs爬片，经含有HSYA和BME的培养基分别处理24h后，用PI荧光染料进行染色处理，于荧光倒置显微镜下进行观并计算各组细胞的凋亡率。2.3SOD和GSH活f生检测按照“方法2.2”分7组处理细胞并分别收集，采用反复冻融法处理所收集的细胞，研磨后加入缓冲液，按试剂盒说明书进行SOD和GSH活性测定，并通过考马斯亮蓝法进行蛋白含量标定。2.4神经分

7、化及免疫细胞化学鉴定待3thMSCs爬片生长至60-70%吋，采用含有最适HSYA保护浓度的保护培养基进行培养24h,然后加入预诱导培养基处理24h,最后更换为神经诱导培养基进行分化诱导，在分化诱导过程中要密切观察细胞的分化情况。2.5RT-PCR检测NSE、MAP-2基因的表达变化各引物的相关信息见表4讨论HSYA具有抗氧化、清除氧自由基及抗炎症作用等多种药理作用，同吋其对免疫系统、心脑血管系统及神经系统均有一定的保护作用。体外将MSCs诱导分化为神经元样细胞的方法较多，而BME+bFGF/EGF几乎

8、成为一种经典，该方法具有诱导效率高，分化后的细胞中少有神经胶质细胞产生的优点，但其最大的缺点是分化后的细胞存活吋间较短。本研究从增强分化前细胞的相对活力、抗氧化及抗凋亡能力等方面出发，旨在为细胞移植、基因转染等其他实验争取时间。实验结果发现，不同浓度的HSYA可不同程度地提高分化前细胞的相对活力和抗氧化力，其中以120mg/LHSYA的保护作用最为显著,口体外HSYA确实可以提高细胞的抗凋亡能力。经120mg/LHSYA保护而分化产生的神经