多角体融合家蚕b细胞受体相关膜蛋白bmbcra高效表达、纯化及功能的研究

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1、浙江理工大学硕士学位论文摘要膜蛋白是生物膜系统含有的一类蛋白，是生物膜功能的主要承担者。膜蛋白的强疏水性和细胞毒性等原因，导致其表达纯化和结晶非常困难。多角体(Polh)蛋白可促进外源基因表达，融合表达产物形成的包涵体颗粒于碱性缓冲液中可溶解，利用多角体的溶解度特性，可用调pH和离心的方法来便捷地纯化目的蛋白。家蚕杆状病毒表达系统是高效的真核表达系统，表达量高且具有翻译后修饰过程，其采用多角体强启动子，可表达一些难表达的蛋白，如膜蛋白。B细胞受体相关蛋白31(BCRA／BAP31)属于BAP31超家族，其参与B细胞活化过程和膜泡运输，具有抗凋亡功能。在家蚕

2、里，该蛋白的相关研究还未见报道。从本实验室的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一个编码家蚕B细胞受体相关蛋白的基因㈣CRA)，在GenBand上的登录号是AK386415．1。构建了表达载体pET-32a-Polh-BmBC'RA，在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了融合蛋白，未加多角体标签的BmBCRA没有表达，说明多角体能促进膜蛋白表达。利用多角体特性，通过调pS和分子筛分离纯化了目的蛋白Polh．BmBCRA，并对其进行了质谱鉴定和抗体制备，进一步用TEV蛋白酶对融合蛋白进行酶切，获得了切除Polh标签的膜蛋白。利用Bac．to．Bac系统构建了重组病毒

3、vPolh．BnmCRA,转染家蚕BmN细胞，发病后经Westernblotting鉴定，结果显示，融合蛋白在家蚕细胞中成功表达，未加多角体标签的BmBCRA没有表达，说明多角体在家蚕细胞中同样能促进膜蛋白表达。同时构建重组病毒vEGFP和vBmBCRA-EGFP，感染家蚕细胞后在荧光显微镜下观察，和单独表达vEGFP的细胞相比，表达BmBCRA-EGFP的细胞，其绿色荧光主要集中在细胞膜附近，初步表明BmBCRA在真核细胞中表达为膜蛋白。荧光定量PCR显示，BmBCRA基因在家蚕马氏体的转录水平最高，其次是中肠和性腺，头部和低。马氏管是昆虫排泄的主要器官

4、，说明BmBCRA蛋白可能在家蚕排泄系统里发挥重要作用。该基因RNA干扰后经MTT和流式细胞仪检测发现，细胞活力下降，凋亡率上升，这和人的B细胞受体相关蛋白(BAP31)的抗凋亡功能一致。本研究主要尝试建立通用的多角体融合高效表达与纯化膜蛋白的方法，为膜蛋白的结晶及功能研究奠定基础。关键词：家蚕；膜蛋白；多角体；荧光定量PCR；RNA干扰浙江理工大学硕士学位论文AbstractMembraneproteinisaclassofproteinswhicharecontainedinbiomembranesystems．Theyarethemainexcuto

5、rforthefunctionofbiomembrane．TheirStronghydrophobicity、celltoxicityandotherreasonsresultingreatdifficultyinexpression,purificationandcrystallizationofmembraneproteins．Polyhedrin(Polh)canpromotetheexpressionofforeigngenes．InclusionbodyparticlescomposedbyfusionexpressionproductCalld

6、issolvedinalkalinebuffer．M撕nguseofthepropertiesofpolyhedra,targetproteinscanbeconvenientlypurifiedbyregulatingpHandcentrifugation．Silkwormbaculovirusexpressionsystemisanefficienteukaryoticexpressionsystems．Ithashighexpressionandtheprocessofpost-translationalmodification．Undertheac

7、tionofstrongpromoterofpolyhedrin,thissystemcailexpresssomeproteinsthatareverydifficulttoexpress，suchasmembraneproteins．Bcellreceptor-associatedprotein31(BCRA／BAP31)belongstoBcellreceptor-relatedproteinfamily．ItisinvolvedintheprocessofBcellactivationandvesiculartransportandhasanti-

8、apoptoticfunction．Insilkworm，ther