s100a4和mmp-9在喉鳞癌中表达及相关性的研究

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1、·中文论著摘要·S100A4与MMP．9在喉鳞癌中的表达及相关性研究吾旨耆莉置喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在我国，东北地区是喉癌的高发区。过去的10年中，我国喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏感，手术是目前治疗的主要手段，但其局部浸润和转移对临床治疗和预后有着重要影响，是造成喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因，而肿瘤侵袭和转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱落，与基底膜粘着，产生蛋白酶降解细胞外基质，侵入血管或淋巴管，诱导肿瘤血管形成，最终在远处形成

2、转移灶。因此探讨与喉癌转移相关的基因对喉癌的治疗和预后具有重要意义。$100家族蛋白属于钙离子结合蛋白，在分子结构具有高度同源性，它们有共同的EF双螺旋结构的氨基酸基序(手型钙离子结合区)，这一基序能够促进其与钙离子高度结合，参与信号转导通路从而调节细胞的生长和分化。作为$100蛋白家族成员，S100A4蛋白通过与钙离子结合在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。人类S100A4基因定位于lq21，编码由101个氨基酸组成的多肽，分子量约为11．7kDa。S100A4参与调节多种细胞内外功能，如细胞生长和新陈代谢，影响细胞骨架形成、改

3、变细胞形状、参与信号传导，调节细胞黏附等。S100A4可作为一种重要的肿瘤调节因子发挥生物学作用，并且与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。研究报道在多种肿瘤组织中$100A4表达升高，如食管癌、胃癌、结肠癌及黑色素瘤等，近来研究发现在乳腺癌中上调$100A4的表达后促进肿瘤细胞转移，而且S100A4阳性表达的乳腺癌患者预后很差。但S100A4参与肿瘤发生和转移的机制仍不十分清楚。基质金属蛋白酶类(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一组锌离子依赖性肽链内切酶，MMPs激活后能够促进肿瘤生长，侵袭和转移，其家

4、族包括21种以上的蛋白酶。其中，MMP．9作为一种92KDA的明胶酶，于1989年首次从人纤维母细胞克隆出来，人MMP．9基因位于染色体20q11．1．13．1。当它激活后能够使胶原蛋白结构发生变形并将其降解，它通过降解细胞外基质和基底膜，从而促进肿瘤侵袭和转移。在正常肺组织中MMP．9极少表达，但是在肺部疾病，如哮喘，肺纤维化，COPD中高表达，亦有研究发现在乳腺癌，结直肠腺瘤和胃癌中MMP．9的表达均比相应的正常组织中增高。它也是作为一种肿瘤促进因子发挥生物学功能。最近有研究发现在前列腺癌PC3细胞系中转染$100A4的表

5、达载体后能够在蛋白水平和mRNA水平上上调MMP．9的表达。所以我们推测在喉癌中$100A4可能调节MMP．9的表达。两者可能在喉的发生发展及淋巴结转移过程中起协同作用。但上述假设是否成立?其具体机制如何?这些问题需要我们进一步研究证实。本研究目的旨在探讨喉组织中S100A4和MMP．9的表达情况及与临床病理学参数的意义。在细胞水平上，通过干扰S100A4，观察其对MMP．9表达的影响。材料与方法一、材料115例喉组织标本(35例癌旁喉组织和80例喉鳞癌组织)，均来自中国医科大学附属第一临床学院2009．2011年耳鼻咽喉头颈

6、外科手术切除的标本，所有患者均为原发，术前均未接受放、化疗。标本经HE常规染色后由两名病理医师明确诊断。其中部分癌旁喉组织(远离肿瘤至少1厘米)和癌组织离体后立即放入液氮后．70。C冰箱保存，以备Westernblot检测。l株喉癌癌细胞株(Hep．2)，用含10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基，在37"(2，5％C02的条件下培养。=、主要试剂和来源S100A4兔单克隆抗体，$100A4siRNA，MMP．9羊单克隆抗体均购自美国SantaCruz公司。Hiperfect转染试剂购自QIAGEN生物公司。SP免疫组化试剂盒、D

7、AB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。三、方法l、免疫组织化学染色及结果判定2标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4pm连续切片，采用链菌素抗生物素蛋白．过氧化物酶免疫组化法(S．P法)检测S100A4和MMP．9蛋白表达。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定：S100A4和MMP．9蛋白以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(x400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数，按S100A4和MMP．9蛋白表达百分率分为以下四个等级：0％为O分，1％．50％为1分，51％．75％为2

8、分，>75％为3分。根据染色强度分为三个等级：浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分<4者判定为阴性，积分>4为阳性。2、WesternBlot在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，15000转／