慢病毒介导bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞生物学特性及硼替佐米敏感性影响的研究

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1、万方数据目录英文略缩词……………………………………………………………………2中文摘要………………………………………………………………………3英文摘要………………………………………………………………………5前言……………………………………………………………………………7第一部分Bmi-1shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转骨髓瘤细胞株的建立引言………………………………………………………………………9材料和方法………………………………………………………………10结果………………………………………………………………………19讨论……………………………………………

2、…………………………21结论………………………………………………………………………24第二部分Bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞生物学特性及增强骨髓瘤细胞对硼替佐米敏感性的机制研究引言………………………………………………………………………25材料和方法………………………………………………………………26结果………………………………………………………………………29讨论………………………………………………………………………39结论………………………………………………………………………42全文总结………………………………………………………………………43参考文献…

3、……………………………………………………………………44致谢……………………………………………………………………………50综述Bmi-1基因在多发性骨髓瘤中的研究进展…………………………511万方数据英文略缩词(Abbreviationsandacronyms)英文略缩词英文全称中文译名RNAiRNAinterferenceRNA干扰shRNAshorthairRNA短发夹RNAshBmi-1Bmi-1shRNABmi-1干扰ControlControl对照组GFPGreenFluorescentProtein绿色荧光蛋白3’UTR3’untreatedr

4、egion3’非翻译区Real-timeQuantitativeReverseqRT-PCR实时荧光定量PCRTranscriptionPCRdoubledistilledwaterddH2O双蒸水mRNAmessengerRNA信使RNALBLuria-BertainmediumLB培养基cDNAcomplementaryDNA互补DNACCK-8CellCountingKit-8细胞计数试剂盒Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TEMEDetr

5、amethylethylenediamine四甲基乙二胺WBWesternBlot蛋白质免疫印迹PBSPhosphateBufferedSolution磷酸盐缓冲液DEPCdiethylpyrocarbonate二乙基焦磷酰胺TBSTTris-BufferedSalineTween-20三羟甲基氨基甲烷缓冲液MMMultipleMyeloma三羟甲基氨基甲烷缓冲液温多发性骨髓瘤-20BorBortezomib硼替佐米IC50halfmaximalinhibitoryconcentration50%抑制率的药物浓度HSCsHematopoieticstemc

6、ells造血干细胞CSCsCancerstemcells肿瘤干细胞2万方数据慢病毒介导的Bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞生物学特性及硼替佐米敏感性影响的研究摘要目的：构建Bmi-1shRNA慢病毒表达载体以沉默Bmi-1基因的表达，建立稳定干扰Bmi-1基因的骨髓瘤细胞株；研究Bmi-1基因沉默对骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226生物学特性及对硼替佐米敏感性的影响及其机制。方法：设计合成一对针对Bmi-1mRNA的shRNA序列，利用分子克隆技术构建慢病毒表达载体—pLVTHM-shBmi-1，空载体作为对照组，分别与包装载体psPAX2及PMD2.G共

7、转染HEK293T细胞，包装出高滴度的病毒颗粒；感染骨髓瘤细胞株U266和RPMI8226，经过流式细胞仪分选获得稳定细胞株。接着应用real-timePCR和Westernblot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1及p14的表达；CCK-8法检测稳定株细胞增殖；克隆形成实验检测稳定株细胞克隆形成能力；流式细胞术(FCM)检测稳定株细胞周期和凋亡的变化；AO/EB染色、Hoechst33258荧光染色法观察稳定株细胞凋亡形态；Westernblot检测P21、Bax和Bcl-2蛋白水平改变。进一步，采用CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术和荧光染色法分

8、别从细胞增殖、克隆形成、细胞周期和凋亡、Westernblot等方