吲哚胺2%2c3双加氧酶在胃癌免疫中作用初步的研究

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1、天津医科人学博十学位论文中文摘要目的：研究胃癌组织中吲哚胺2，3一双加氧酶(Indoleamine2,3．dioxygenase，IDO)的表达情况和CDllc+树突状细胞(CDI1c+DC)的分布情况，探讨胃癌组织中IDO的表达、CDl1c+DC的分布与患者临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。构建IDO真核表达载体plRES2．EGFP—IDO，转染树突状细胞(IDO—DC)，考察体外IDo—DC对异体反应性T细胞增殖的影响。方法：1选取2001年1月至2007年6月天津医科大学附属肿瘤医院65例手术治疗胃癌患者的组织蜡块，免疫组织化学法检测

2、IDO的表达情况、CDl1c+DC的分布情况，观察IDO的表达、CDl1c+DC的分布与临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。2钓取IDO基因编码序列(CDS)区域，克隆至pMD19．Tsimple载体中，测序验证后连入真核表达载体plRES．EGFP，构建plRES．EGFP．IDO重组质粒。将IDO真核表达载体plRES．EGFP．IDO电转染至胃癌患者外周血单核细胞来源DC，构建表达IDO的DC，RT．PCR检测IDO基因的mRNA的表达，Westernblot检测IDO基因的表达，氨基酸分析仪测定IDO蛋白的酶活性。3分选并纯化异体胃癌患

3、者外周血CD3+T细胞，将其与IDO—DC共孵育，以转染空质粒组和未进行转染的DC为对照。检测体外IDO对异体反应性T细胞增殖的影响。结果：1免疫组化结果显示：胃癌组织和正常胃黏膜组织中IDO阳性表达率分别为47．7％(31／65)和22．7％(5／22)，统计学分析显示，胃癌组织中IDO阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织(置匀．223，P=0．040)。胃癌组织中IDO的表达与胃癌患者的TNM分期、肿瘤直径、病理类型及淋巴结转移具有显著正相关。2免疫组化结果显示：胃癌组织中CDllc+DC浸润的数量为23．28士10．34，正常胃黏膜组织中CDll

4、c+DC浸润的数量为28．75士5．78，统计学分析显示，胃癌组织中CDllc+DC的数量显著低于正常胃黏膜组织(仁2．568，P=0．043)。胃癌组织中CDl1c+DC的数量与胃癌患者的TNM分期、病理类型及淋巴结转移具有显著负相关。．，天津医科大学博士学位论文3预后分析显示，淋巴结转移、TNM分期、肿瘤直径、T分期、CDl1c+DC数量和IDo的表达情况是胃癌患者预后的影响因素。进一步多因素分析显示，TNM分期和IDO的表达情况是胃癌患者预后的独立影响因素。4检测未转染DC、转染空质粒组和IDo—DC组的IDOmRNA的表达，IDO／p．ac

5、tin灰度值之比分别为(0．1183+0．0602)、(0．11904-0．0547)和(0．5627+0．1414)，IDO．DC组灰度值明显高于另外两组(F=29．638，P<0．001)。Westernblot检测IDO．DC中IDO蛋白的表达情况，可检测到相对分子量约为42KD的蛋白质，提示外源性IDO基因在IDO．DC成功表达。在IDO—DC组和未转染DC组的细胞培养上清液中色氨酸(Trp)浓度分别为(3．23+0．53)mg／L和(6．034-0．51)mg／L，差异有统计学意义(t=-13．32，P<0．001)：犬尿氨酸(Kyn)浓

6、度分别为(4．84：t：0．11)mg／L和(1．834-0．10)mg／L，差异有统计学意义(t=42．916，P<0．001)，提示IDO．DC表达的IDO具有完整的酶活性。5未转染组、转染空质粒组及IDO．DC组对异体反应性T细胞增贿影响的差异具统计学意义(庐4．595，P=-0．042)。与转染空质粒、DC组比较，IDO．DC对异体反应性T细胞具有明显抑制活性(P

7、径、淋巴结转移具有相关性；CDl1c+DC的分布与TNM分期、病理类型、淋巴结转移具有相关性，提示胃癌组织中IDO、CDl1c+DC可能参与胃癌的进展、转移过程。2胃癌微环境中的IDO的表达水平是独立预后影响因素，可作为判断患者预后的指标。3成功构建了IDO重组真核表达载体plRES．EGFP．IDO，并成功转染了DC。IDO的活性表达可导致微环境中色氨酸耗竭，并产生其分解代谢产物，如犬尿氨酸等衍生物。4体外实验证实DC上IDO可以抑制异体反应性T淋巴细胞的增殖过程，这提示IDO可能通过抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖，从而影响了机体局部免疫反应。关

8、键词：胃癌吲哚胺2，3一双加氧酶树突状细胞免疫耐受转染IIAbstractobjective：Toinvestigatet