丝素蛋白作为促血管生长基因载体的研究

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2、师签。名El期：之!垡：至：翌El期：趁：妄：12＆素蛋自作为促血管生长基周载体的研究中文摘要丝素蛋白作为促血管生长基因载体的研究中文摘要血管的再生是组织工程及原位组织再生领域面临的关键问题。利用转基因技术，将促进血管再生的生长因子基因导八目的细胞并使其表达，可有效促进血管生成。VEGFl65和Ang．1是两种最重要的促血管再生生长因子。VEGF作用于血管形成的早期，促进原始血管网的形成，Ang-1则作用于其后的血管改建、塑形，促进形成成熟的且具有空间结构的血管网。联合使用VEGFl65和Ang-1双基因转染细胞，则既有利于相互协调共同促

3、进血管的形成，又可使新生血管获得持久稳定的结构。为了将目的基因导入靶细胞，需要依靠基因传递载体。分子量为25kDa的支链PEI是迄今最成功的非病毒高分子基因载体，其表面带有高密度的正电荷．转染效率较高，但细胞毒性较大。丝素蛋白是一种具有良好细胞相容性和可降解性的蛋白质，丝素分子带负电，不能直接包装DNA．但是能够屏蔽PEI多余的正电荷，减小细胞毒性。同时柞蚕丝素蛋白内存在细胞特异性粘附序列RGD，可以与血管内度细胞，成纤维细胞等细胞表面的受体发生特异性相互作用a因此，用丝素和PEI共同包装质粒DNA，作为基因传递载体，可以通过细胞表面受体

4、介导的特异性相互作用及其内吞作用，代替PEI和细胞的非特异性静电相互作用，以降低细胞毒性，提高转染效率。本文以丝素和PEI共同作为VEGFl65和Ang-1职基因共表达质粒的传递载体，研究与PEI单独作为传递载体相比，载体的形态、结构、理化性质的变化，及其对细胞毒性、转染效率的影响，并对其影响机制进行初步探讨。首先，通过静电吸附方法制备PEI／DNA复合物，DNA的含量为2ag／ml。用琼脂糖凝胶电泳确定能完全包被质粒时，PEI与DNA的N／P比大于3。MTT法证明，细胞培养液中PEI含量在I-5．g／m1时，细胞存活率都在90％Og上，

5、细胞毒性较低。PEI含量为3ug／mi时(其中，PEI／DNA复合物的含量为5删，DNA的含量为2I．tg／m1)，荧光强度最强，转染效率最大，且细胞毒性较低。其次，分别用柞蚕丝素(Antheraeapernyisilkfibroin,ASF)和家蚕丝素(Bomb?ixI中文摘要＆寨蛋自作为促m管生长基因载体的研究morisilk丘broin,BSF)包被pEI／DNA，得到ASF／PEI／DNA和BSF／PEUDNA复合物。用x．射线能谱分析了复合物表面元素的含量变化，证明蚕丝丝素可以结合到PEI／DNA表面。原子力显微镜(AFM)和激

6、光粒度仪∞Ls)测试结果显示ASF和BSF都可以包被PEUDNA形成纳米级颗粒，PEVDNA的平均粒径为2743±34nm，ASF／PEI／DNA的平均粒径是3376士74nm，SF／PEI／DNA复合物的粒径与PEI／DNA相比有所增大。ASF／PEI／DNA和BSF／PEI／DNA的表面电位与PEl／DNA相比有明显降低。SF／PEI／DNA三元复合物能抵抗核酸酶的降解。晟后，分别用ASF／PEI／DNA和BSF／PEI／DNA转染L929细胞，激光共聚焦显微镜(LSCM)观察转染情况，流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比率

7、。结果表明，ASF／PEI／DNA复合物的转染效率比PEI／DNA复合物的高。转染CHL细胞后，出现了相似的结果。IVITT法铡试结果显示ASF／PEI／DNA组的细胞存活率大于PEI／DNA组的细胞存活率。用ASF与PEI共包被DNA后，一方面能够通过受体介导的内吞作用，增强复合物对细胞的靶向性：另一方面能降低复合物的细胞毒性，使细胞生长状况和功能良好，有利于转录和翻译，从而提高VEGF—An争1双基因共表达质粒的基因转染效率。细胞经转染携带双基因片段的质粒后，VEGF的分泌比同种条件下的携带单基因的质粒组分泌的VEGF多。同一时间点，

8、ASF／PEI／DNA组细胞比其它组细胞分泌的VEGF多。证明用ASF与PEI共同包被DNA，不仅能够提高转染效率，而且转染后的VEGF基因能够正常表达、分泌VEGF。本文首次用柞蚕丝素蛋白和