复合生长因子和基因制备促血管再生活性支架的研究

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1、浙江大学博上学位论文(2007)摘要随着再生医学／组织工程的发展，人们对支架材料的要求也不再局限于生物相容性，而要求支架具有生物活性，能够促进细胞增殖、分化，从而引导组织再生。本文首先尝试了用生长因子构建活性支架。采用层层自组装技术，在TCPS表面成功地构建了(aFGF／heparin)／PEI自组装多层膜。体外成纤维细胞培养的结果证明，aFGF在多层膜中仍然保持一定的生物活性，可促进成纤维细胞增殖并促进I型胶原和白介素6的分泌。体外PBS浸泡实验显示(aFGFmeparin)／PEI多层膜具有一定的稳定性，但浸泡48h后，多层膜的生物活性显著下

2、降，而保存在一200C可以有效地保持多层膜的生物活性。将层层自组装技术成功地应用于胶原多孔支架的改性，构建了具有生物活性的胶原支架。成纤维细胞在该支架中的MTT活性有所提高，但不显著。针对生长因子活性不易保持、难以控释、价格昂贵等缺点，我们进行了将表达生长因子的基因及其载体与组织工程支架相结合，从而构建活性支架的探索。我们制备了N一三甲基壳聚糖(TMC)和N一三甲基壳寡糖(TMO)，可通过反应时间控制其季铵化程度。TMC／TMO可与DNA通过静电作用形成几百纳米大小的微粒，其尺寸受N／P值调控。较高的季铵化程度可以获得较小的复合物微粒。载体与DN

3、A的结合能力随着季铵化程度的增加而增大，形成复合物的表面电势亦随之增大。载体的毒性随季铵化程度和分子量的增加而增大。细胞对复合物微粒的吞噬量随着TMC的季铵化程度增加而增加，但载体的基因转染能力随季铵化程度增加而先增加后降低，其转染能力优于PEI，但仍低于Lipofectamine2000。制备了聚N一异丙基丙烯酰胺和TMC的接枝共聚物(TMC—g．PNIPAAm)，其LCST为320C。TMC—g．PNIAAm共聚物的LCST随盐溶液浓度的增大而减小，但不受pH值影响。TMC—g—PNIPAAm仍NA微粒的大小在200～900nm之间，温度对微

4、粒粒径的影响不显著。微粒的表面电势和TMC—g—PNIPAAm与DNA的结合力受温度调控。接枝PNIPAAm对370c下的细胞吞噬行为没有明显影响。TMC—g—PNIPAA州DNA微粒的基因转染效率受温度调控，降低温度可以显著提高TMC—g．PNIPAAm的基因转染效率。其最佳转染效率与Lipofectamine2000相当，而细胞毒性则显著低于Lipofectamine2000。摘要以二氧化硅微粒为模型，在其表面接枝7lat多肽。’lat接枝量可由投料量控制，并且接枝Tat对微粒的物理性质无显著影响。发现Tat多肽可介导细胞对微粒的吞噬，同时还

5、会改变胞吞后微粒在细胞内的分布，可将微粒导入细胞核区。使用戊二醛可以有效地将Tat多肽接枝到TMO／DNA微粒上，通过反应条件可控制Tat接枝量。接枝Tat多肽对TMO／DNA微粒的物理性质和细胞毒性无显著影响，但可显著提高细胞吞噬量和基因转染效率。以表达VEGF的质粒DNA为模型，将载体／DNA微粒通过物理吸附的方法复合到胶原支架中，结合量受微粒浓度调控。载体／DNA微粒在支架中有‘定的缓释能力。将负载载体／DNA微粒的胶原支架埋植到大鼠体内，发现可显著促进血管长入支架并提高支架内血管密度。并且随着DNA浓度提高和载体的转染效率提高，其促血管牛

6、成能力也相应提高。证明负载基因的活性支架存诱导组织，血管再生力面有良好的应用前景。关键词；再生医学、组织工程、基因传递、活性支架、血管化、N一三甲基壳聚糖、温度响应、Tat多肽lI浙江大学博士学位论文(2007)AbstractOnestrategyforregenerativemedicineistoinducetissueregenerationatdamagedtissuesororganswitheithertransplantedcellsorhostcells．Thiscellinducedtissueregenerationisac

7、hievedbyprovidingalocalenvironmentwhichenablescellstopromoteproliferationanddifferentiation．Ithasbccnrecognizedthattheenvironmentisnaturallycomposedofbiologicalsignalmolecules，extracellularmatrix(ECM)molecules，mechanicalstress，andcell-callinteractions．Thus，‘‘bioactive”scaffbl

8、dwithanappropriatecombinationofthebiologicalcuesmaymodifycellactivit