猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1蛋白锌指结构突变体构建及其活性检测

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1、万方数据ConstructionofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusNsp’1ProteinZincFingerStructureMutantsandItsActivityDetectionsThesissubmittedtoQ芗ngDaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyZhaoPengwei(DepartmentofAnimalScienc

2、eandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfessorWangJinbaoQingdao．China万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我～同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：走潞传·时间：w房年历≮扫关于论文使用授权的说明本人完全了解

3、青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协调研究生签名：是孑坪岛名扣时间：钼f≥年钿芗汐日导师签名：多雾参时间：≯萨石月妒万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒Nspl蛋白锌指结构突变体构建及其活性检测摘要猪繁殖与呼吸综合征-(Porcinereproductiveandrespira

4、torysyndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gl起猪的一种高度传染性疫病，该病毒感染后可导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄猪不同程度的呼吸道症状，并且能够破坏猪的免疫系统，引起混合感染和继发感染，给我国养猪业造成巨大的经济损失。从山东省猪主要疫病的调查研究中发现，PRRSV的感染率仍然很高，并且PRRSV能够抵抗宿主的先天性免疫应答，抑制I型IFN的产生，从而影响宿主获得性免疫应答的产生。因此对PRRSV的抑制机体I型IFN产生机制研究显得尤为重要。目前，国外对

5、PRRSV的非结构蛋白Nspl研究发现，PRRSV是引起机体I型干扰素(IFN)下调的主要蛋白。但是这些研究都是针对Nspl整个蛋白的研究，而对Nspl蛋白的氨基酸序列中具体起I型IFN下调作用的蛋白区段没有做进一步的研究。本研究主要采用美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒SX．1株作为阳性对照，选取Nspl蛋白基因序列为模板，设计了2条特异性的检测引物扩增Nspl基因。利用Tmzol法提取总RNA，RT-PCR扩增目的基因，经双酶切构建pCI．neo-Nspl真核表达质粒后对Nspl蛋白锌指结构I(ZFI)的8C、10C、25C、28

6、C的4个位点进行定点突变，成功获得分别突变为丝氨酸和丙氨酸8个突变体。转染HeLa细胞，通过间接免疫荧光方法(IFA)和Westernblot检测Nspl锌指结构定点突变体蛋白的活性。IFA结果显示，Flag：I％体检测时蛋白主要分布在细胞质和细胞核中，Mycjg体检测时蛋白主要分布在细胞核中。Westemblot结果显示，Flag-fA体检测时，丝氨酸突变体出现大小约为44kDa和20kDa的条带，丙氨酸突变体出现大约44kDa,条．带；Myc抗体检测时丝氨酸突变体出现大小约为44kDa和27kDa的条带，A突变体出现大约44

7、kDa条带。该方法成功构建了Nspl突变体的真核表达质粒，证实其能在真核表达细胞中可以表达，为进一步研究Nspl蛋白的锌指结构是否对机体I型IFN产生起下调作用提供基础。’关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SX．1株；N￡；pl；序列分析；突变体构建；活性鉴定万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractConstructionofPorcineRreproductiVeandRespiratorySyndrFingerStructur0meVlrUSIT●eMutantsDetectionsAbstractNspl

8、ProteinZincandItsActivitvVPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)，alsoknownas‘‘blueeardisease",whichiscausedbyPRRSV(Porcine