熔解分析衍生技术在骨髓增殖性肿瘤分子标志物jak2 v617f突变检测中的应用

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1、万方数据复旦大学硕士论文学科：临床检验诊断学专业：肿瘤分子的遗传与表观遗传研究熔解分析衍生技术在骨髓增殖性肿瘤分子标志物yAK2V617F突变检测中的应用ApplicationofMeltingCurveAnalysisDerivedTechniques：Detectionof]AK2V617FMutationinMyeloproliferativeNeoplasms指导教师：关明教授导师组成员：关明教授吕元教授口／L琶＆￡《许小平教授万方数据复旦大学硕士论文ILLIIIIIIIIIIIIIILLIIIIILLIkLLLIIIIIIIIILLI[I

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3、⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一28一第二部分茎环探针熔解曲线分析技术在JAK2V617F突变检测中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-31-材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32一结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一36一讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．-41-研究结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．-44-参考文献⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-47-综j苤⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．．⋯-54-致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．一70-万方数据复旦大学

4、硕士论文中文摘要熔解分析衍生技术在骨髓增殖性肿瘤分子标志物JaK2V617F突变检测中的应用第一部分使用非标记探针一熔解曲线分析技术检测真性红细胞增多症患者外周血中JAI；2V617F突变及该检测体系在多种荧光定量平台上的验证目的：利用3’端封闭的非标记探针建立一种基于熔解曲线分析检测真性红细胞增多症患者外周血中以／(2V617F突变的方法，并将该方法进行多实验室仪器平台间的比对验证。方法：在RotorGeneQ高分辨率熔解分析平台上构建非标记探针一熔解曲线分析检测体系。使用不对称PCR扩增埘肠V617F突变侧翼区域，并在反应体系中加入与所扩增突变

5、型单链完全匹配的非标记探针及饱和染料。在扩增反应结束后对反应产物进行熔解分析，通过熔解曲线中突变峰的表达情况对样本所含突变进行鉴定。分别以人多发性骨髓瘤细胞株RPMl8226(以勉野生纯合子)与人红白血病细胞株HEL(朋勉V617F突变纯合子)DNA作为突变阴、阳质控，通过系列稀释实验制备含有0％、1％、3％、5％、10％、25％、50％及100％突变负荷的20ng／mlDNA标准品进行检测，以评估所构建检测体系的灵敏度。使用体系突变检出下限的DNA标准品进行20次批内检测与连续20天批间检测，以突变与野生产物熔解温度的变异系数评估体系的检测批内与

6、批间不精密度。使用等位基因特异性扩增(ARMS)、Sanger测序与非标记探针熔解分析系统同时检测40例真性红细胞增多症患者与40例健康志愿者外周血DNA中埘K2V617F突变情况，以评估体系检测正确性。最终将所构建体系移植至不同实验室的LightCycer480及PRISM7500、Mastercyclereprealplex等仪器上并对检测结果进行比对，以评估所构建方法的实用程度。结果：对于Rotor-GeneQ高分辨率熔解分析平台，所构建非标记探针熔解分析．m肥V617F突变检测体系可在57．3±0．7℃及63．6±1．1℃分别形成突变与野生

7、熔解峰。梯度稀释实验证实体系可在20ng／ul模板背景中检测负荷为3％的突变。野生型与突变型产物探针熔解温度的批内不精密度分别为1．72％与1．29％，批间不精密度分别为3．14％与3．55％。非标记探针体系与ARMS检测结果完全一致，T—A万方数据复旦大学硕士论文克隆证实非标记探针体系可检出Sanger测序结果为假阴性的样本，且与使用LightCycer480及PRISM7500、Mastercyclereprealplex等仪器的检测结果也均完全一致。结论：研究使用非标记探针技术构建了可用于检测骨髓增殖性肿瘤诊断标志物埘勉V617F突变的反应体

8、系。该检测体系可对突变进行陕速的闭管检测，并适用于各种带有熔解分析功能的荧光检测仪，对于辅助临床进行骨髓增殖性肿瘤诊断具有