旁分泌或自分泌细胞因子在乳腺癌上皮—间质转化(emt)及耐药和转移中的作用

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1、中图分类号UDC610博士学位论文学校代码!Q§33密级公珏旁分泌或自分泌细胞因子在乳腺癌上皮一间质转化(EMT)及耐药和转移中的作用ParacrineorAutocrineSignalsInduceandMaintainMesenchymalStatewithDrug--resistanceandStemCeUtraitsinBreastCancerCells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期训．-’垆郑国沛病理学与病理生理学肿瘤耐药的分子机制肿瘤研究所贺智敏教授答辩委员会主席中南大学二0一三年

2、六月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：诹日期：盟年j月』日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容

3、，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。本课题受如下基金资助中国国家自然科学基金(30873088)中国国家自然科学基金(81272450)蠖±堂僮途塞生塞撞要旁分泌或自分泌细胞因子在乳腺癌上皮一间质转化(EMT)及耐药和转移中的作用摘要研究背景与目的乳腺癌是女性中发病率最高、危害最严重的恶性肿瘤之一。近年来，随着治疗手段的更新、治疗方案的改进及治疗方式的多样化，乳腺癌的临床治疗效果得到了很大改善，然而目前全世界每年仍

4、有约50万人死于乳腺癌。长期研究表明：非手术治疗耐受和手术前后的转移是乳腺癌死亡的重要原因，乳腺癌治疗耐受与侵袭转移密切相关，如耐药乳腺癌更易发生远处转移，而转移的乳腺癌更具药物耐受性。但由于乳腺癌细胞和分子异质性明显，其非手术治疗耐受及早期微转移和晚期转移机制，尤其是耐受和转移之间的内在联系一直未予阐明。晚近较多的文献报道：乳腺癌发生发展和治疗过程中出现的上皮．间质转化(epithelial．mesenchymaltransition，EMT)与其细胞转移和耐药表型发生均存关联，较为一致的解释是，EMT后的细胞粘附能力降低、易自

5、原发灶脱落，且易穿过血管壁而远处迁移；同时EMT过程使乳腺癌干细胞得以富集，继而增强细胞的药物抗性、凋亡抗性及转移能力。可见，乳腺癌EMT形成机制的阐述将可望阐述乳腺癌耐药、转移机制以及二者内在联系的规律。肿瘤细胞EMT启动与肿瘤微环境的改变相关，肿瘤细胞、肿瘤问质细胞、免疫细胞在肿瘤微环境变化时能自分泌或／和旁分泌一系列细胞因子来启动EMT进程，不幸的是手术、放化疗等均能引起微环境的改变，可见化疗、放疗在杀灭肿瘤细胞的同时也能诱导肿瘤细胞EMT及耐药和转移。为了探讨乳腺癌化疗耐药与转移的分子机制，一系列的细胞或动物模型相继建立，

6、通过模型虽然鉴定了一系列的耐药或转移相关因子，但对这些因子的干预仍不能很好的解释或逆转肿瘤的耐药或转移现象。随着研究的深入，肿瘤微环境与肿瘤侵袭转移的关系已日益明确，而肿瘤微环境与肿瘤治疗反应或肿瘤耐药之间的关系研究报道仍然甚少。本课题组前期建立了乳腺癌5．Fu耐药细胞系MCF．7／5．Fu，发现该细胞系不仅耐药指数增高，还呈现典型的EMT形态特征；进一步基因表达谱芯片检测发现一系列EMT相关基因和细胞因子在耐药细胞(MCF．7／5．Fu)和亲代细胞(MCF．7)存在明显的差异表达。本课题将在验证EMT相关细胞因子TGF[32在乳

7、腺癌耐药中的作用和调节的基础上，重点探讨体外培养细胞微环境对肿瘤细胞EMT及耐药和转移的影响，筛选和鉴定参与调控的关键细胞因子，为阐述乳腺癌EMT及其在耐药和转移中的调控机制，乳腺癌耐药和转移的相互影响机制提供新的证据：为筛选和鉴定乳腺癌耐药和转移新的标志物，开发以标志物为靶点的可望干预和逆转乳腺癌耐药和转移的新药提供理论依据。方法(1)通过miRNA芯片筛选MCF．7／5．Fu细胞中的差异表达miRNAs并用miRNA特异性qRT-PCR验证，结合生物信息学分析对接前期差异基因芯片结果以预测可能靶向调控TGFl32的miRNAs

8、；在8株乳腺癌细胞系中验证miRNAs与TGFl32的相关关系；将两个CopymiRNA前体克隆入pLEX．MCS慢病毒载体分别构建miR．141、miR．200a和miR．145过表达的慢病毒表达系统，用经293T细胞包装后的病毒颗粒感染TGFl