tgfβ2经snail介导的上皮--间质转化(emt)在乳腺癌5--fu耐药中的作用及机制

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1、分类号VDC博士学位论文密级TGFI玉2经Snail介导的上皮一间质转化(EMT)在乳腺癌5-FU耐药中的作用及机制TGFp2／Snail—mediatedEMT．confers5-FUresistanceinhumanbreastcancer’研究生姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：论文答辩日期一兰尘‘6I张为家病理学与病理生理学肿瘤耐药及其机制研究中南大学肿瘤研究所答辩委员会主态途中南大学二O一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人

2、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：水为象学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：j鳖导师签每趔‰：搏上月坦日博士学位论文

3、中文摘要摘要研究背景与目的乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤，发病率位居全球女性恶性肿瘤的第一位。化疗在乳腺癌综合治疗中起着举足轻重的作用。5-FU是乳腺癌的一线化疗药，尽管乳腺癌对5．FU相对敏感，化疗耐药及耐药后肿瘤复发转移仍然是导致肿瘤病人死亡的重要原因。而乳腺癌5-FU耐药机制，目前尚未阐明清楚。上皮间质转变(Epithelial．to．mesenchymaltransition，EMT)是指上皮细胞形态向间充质细胞转变，细胞获得迁移运动能力。最近文献报道，EMT与肿瘤转移、耐药和肿瘤干细胞密切相关。研究表明，多种获得性耐药的肿瘤细胞具有EMT和肿瘤干

4、细胞特点；TGF]3等体外诱导细胞发生EMT改变，细胞对化疗药物表现出更强的耐受性。而EMT与乳腺癌5-FU耐药是否相关，目前国内外尚未见报道。本实验室前期以5-FU诱导建立了乳腺癌耐药细胞(MCF7／5．FU)，与亲本细胞(MCF7)相比，MCF7／5一FU细胞变得狭长，细胞之间连接松散，呈现间充质细胞样形态。前期基因表达谱芯片结果显示亲本细胞与耐药细胞中诸多EMT调节因子存在明显差异表达。本研究拟此耐药细胞为模型，结合差异基因芯片结果，探讨上皮．间质转化在乳腺癌5-FU耐药中的作用及机制，揭示乳腺癌5．FU耐药与EMT及肿瘤干细胞之间的联系。以期为阐明乳腺癌5

5、-FU耐药发生发展机制启发新的思路，为预测5-FU化疗敏感性提供新的靶分子及逆转5-FU耐药提供新的策略。博士学位论文中文摘要方法本课题受中孽甲萝观察糊尹8和MCF7／5．FU细胞的形态；qRT-PCR、Westemblot检测EMT标志物的表达；Attachment、Detachmet实验及Transwell迁移、侵袭实验评价侵袭转移能力；流式细胞术分析CD44+CD24√10w干细胞亚群的比例，微球体形成能力评价自我更新潜能，流式细胞术检测SP细胞亚群。(2)采用RNA干扰技术沉默MCF7／5．FU中Snail的表达，比较干扰组和干扰对照组细胞形态、EMT标志

6、物、迁移侵袭能力、肿瘤干细胞之间的差异。然后，采用qRT-PCR、Westernblot检测Snail下游靶分子MMPs的表达，明胶酶谱法检测MMP．9的活性。MTS、AnnexinV／PI检测5-FU化疗敏感性，Westemblot检测Snail下游P53及其凋亡相关信号通路。接下来，转染野生型P53至MCF7／5．FU中，检测EMT、对5-FU的耐受是否逆转。(3)qRT-PCR、Westernblot、ELISA分析MCF7和MCF7／5．FU中TGFl32的表达及分泌，以TGF[32中和抗体处理MCF7／5．FU细胞评价EMT、肿瘤干性及5．FU耐药是否逆

7、转。Westernblot检测TGFp2下游Smad和非Smad信号通路ERK，NF．rd3在MCF7、MCF7／5．FU、及TGFIB2中和抗体处理及对照处理的MCF7／5．FU细胞中的活化情况。分别以Smad2抑制剂Staurosporine，ERK抑制剂PD98059，NF—rd3抑制剂Bay一117082处理MCF7／5．FU细胞，评价EMT是否逆转。干扰Snail后检测TGFl32／Smad信号通路的变化。MTS检测乳腺癌多个细胞系对5-FU的敏感性，评价细胞的EMT特征，验证TGFfl2／Smad／Snail信号通路在各细胞中的表达及活化。(4)评价不

8、同剂量me