twist在骨肉瘤转移和上皮间质转化中作用及机制

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1、中图分类号UDCR738。l601博士学位论文学校代码密级10533Twist在骨肉瘤转移和上皮间质转化中作用及机制TheEffectandMechanismofTwistonMetastasisandEpithelialMesenchymalTransitionofOsteosarcoma作者姓名：尹科学科专业：临床医学研究方向：外科学(骨科专业)学院(系、所)：湘雅医院指导教师：廖前德教授论文答辩日期p。乃●9答辩委员会主席中南大学二O一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽

2、我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：盟日期：盟年』月丛日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国

3、学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。撇名：盟翩签磁期：旦年三月旦日博士学位论文中文摘要Twist在骨肉瘤转移和上皮间质转化中作用及机制摘要目的：1．研究Twist基因在骨肉瘤组织的表达情况，探讨Twist对骨肉瘤患者诊断、预后的关系；2．通过沉默Twist基因表达，观察Twist基因对骨肉瘤细胞MG一63中EMT相关蛋白表达及细胞生物学行为能力的影响，分析Twist基因对骨肉瘤转移及EMT的作用和机制。方法：1．使用免疫组化方法检测107例骨肉瘤患者和25例骨纤维结构不良组织患者石蜡标本中Twist基因表达情况，结合

4、患者临床资料分析Twist基因表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理亚型、复发、转移等临床特征之间的联系；2．使用免疫组化方法检测107例骨肉瘤患者石蜡标本中E钙粘蛋白基因表达情况，使用Spearman等级相关检验分析Twist基因表达与E钙粘蛋白表达的关系，使用Kaplan—Meier法和对数秩检验分析Twist基因表达与E钙粘蛋白表达与骨肉瘤患者生存率的关系，使用多因素Cox回归分析预测骨肉瘤患者预后风险因素；3．采用脂质体法在骨肉瘤细胞MG-63中转染特异性TwistsiRNA，采用RT—PCR法和Western-blot法检

5、测TwistmRNA和蛋白表达，筛选干扰效率最佳的siRNA；采用RT—PCR法和Western-blot法检测E钙粘蛋白、N钙粘蛋白、B一环连蛋白的mRNA和蛋白表达；采用MTT法检测细胞增殖情况，采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡情况，采用Transwell小室迁移、侵袭实验检测细胞迁移能力和侵袭能力。结果：1．骨肉瘤标本中Twist阳性表达率为31．8％(34／107)显著性高于骨纤维结构不良标本中Twist阳性表达率8．0％(2／25)，(斥5．776，P

6、要52．8％(28／53)高于无肿瘤转移的Twist表达阳性率11．1％(6／54)，(if=21．474，P<0．05)。2．骨肉瘤标本中E钙粘蛋白阳性表达率为20．6％(22／107)；E钙粘蛋白阳性表达与骨肉瘤病理亚型、转移临床特征相关(斥10．046，Y<0．05；斥11．548，P<0．05)；E一钙粘蛋白表达与Twist表达在骨肉瘤标本中为负相关(肝一0．209，P<0．05)；Twist表达阳性的骨肉瘤患者总体生存率和无病生存率比Twist表达阴性的骨肉瘤患者低(均P<0．05)，E钙粘蛋白表达阴性的骨肉瘤患者总体生存率低

7、于E钙粘蛋白表达阳性的骨肉瘤患者(尸<0．05)，E钙粘蛋白表达阴性的骨肉瘤患者与E钙粘蛋白表达阳性的骨肉瘤患者在无病生存率方面无显著性差异(D0．05)；年龄和Twist表达是影响无病生存率和总体生存率的独立风险因素(均P<0．05)。3．三组TwistsiENA阳性组中TwistsiRNA#806组沉默Twist基因效果最明显；利用RT—PCR和Western—bloting检测：E钙粘蛋白mRNA和蛋白的表达水平TwistsiRNA#806组高于TwistsiRNA#NC组和空白组(P<0．05)；N钙粘蛋白和B一环连蛋白的mRN

8、A和蛋白的表达水平TwistsiRNA#806组低于TwistsiRNA#NC组和空白组(Y<0．05)；4．在12h、24h、48h、72h时MTT结果显示TwistsiRNA#806组细胞增殖明显低于T