恩诺沙星单克隆抗体的制备鉴定及其胶体金免疫层析试纸条的研制

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1、内蒙古医学院硕士学位论文恩诺沙星单克隆抗体的制备鉴定及其胶体金免疫层析试纸条的研制姓名：王羚鸿申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：俞腾飞;娜荣20090501内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2009年)中文摘要目的制备抗恩诺沙星单克隆抗体，在此基础上建立酶联免疫分析方法，同时研究开发胶体金免疫层析试纸条检测恩诺沙星的残留，为现场快速检测恩诺沙星的残留提供新的借鉴和方法。方法采用N一羟基琥珀酰亚胺法合成2种人工抗原，采用FeCl3显色法、MALDI—TDF—MS法对人工抗原进行鉴定同时测定偶联比。将免

2、疫抗原腹腔注射免疫Bmj3／C小鼠，采用杂交瘤技术筛选出特异性分泌抗恩诺沙星单克隆抗体的细胞株并扶敢旋水。建立酶联免疫分析方法检测恩诺沙星的残留，绘制恩诺沙星竞争抑制曲线，确定其检测限(LOD)、半数抑制率(I‰)及与其他抗菌药物的交叉反应率(CR％)，测定恩诺沙星在牛奶、鸡蛋、血清中的回收率及变异系数(CV％)o同时，依据免疫层析技术研制恩诺沙星残留检测的胶体金免疫层析试纸条。结果(1)成功合成了2种恩诺沙星人工抗原Enm-BSA与Enro-OVA，FeCl3显色法结果证明恩诺沙星与BSA及OVA的偶

3、联成功，MALDI—TOF—MS法测定Enro-BSA的偶联比为13：10(2)采用杂交瘤技术筛选出2株特异性分泌抗恩诺沙星单克隆抗体的细胞株1A10和4812并获取腹水，纯化后腹水效价为l：1281Xg)000(3)绘制了恩诺沙星竞争抑制曲线，单抗的最佳稀释倍数为1：320000，检测抗原＆lro—OVA工作浓度为37．5ng／mlo标准曲线在0．1-1000ng／ml之间线性关系良好(砰=O．9961)，LDD=0．1ng／mi，l岛=2．6ng／mi。交叉反应结果表明，恩诺沙星与环丙沙星、马波沙星

4、及氧氟沙星CR％为0．26％，与诺氟沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星、达氟沙星CR％dx于0．01％，与不同族的氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、头孢氨苄等没有交叉反应o(4)测定牛奶、鸡蛋、血清中恩诺沙星的平均添加回收率分别为87．00～110．00％、60．00～77．69％、79．14％～87．00％，CV％分别为4．7～11．2％、7．9～16．9％、3．9～7．1％。(5)胶体金标记恩诺沙星单克隆抗体的最佳粒径为20rim，单克隆抗体最佳标记浓度为7．7pg]ml，目测灵敏度为20

5、n∥rnl，3min内显示结果，与喹诺酮类和其他抗菌药物在100ndn-a以下均无交叉反应。结论在恩诺沙星单克隆抗体成功制备的基础上，依据免疫层析技术研制出的恩诺沙星残留快速检测胶体金免疫层析试纸条，检出限符合欧盟标准，具有灵敏、快速、简便、特异等优点，适用于恩诺沙星残留的现场快速检测的推广应用。关键词恩诺沙星单克隆抗体间接竞争ELISA胶体金免疫层析技术内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2009年)PreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodyagain

6、stEnrofloxacinandDevelopmentofColloidalGoldImmunochromatagraphyTestStripsofEnrofloxacinAbstractObjectivePreparationmonoclonalantibodiesagainstenrofloxacin，establishmentofEnzyme—linkedimmunosorbentassaybasedonit，researchanddevelopmentofthecolloidalgoldimm

7、unochromatagraphyteststripsofenrofloxacinresiduedetection，whichprovidesanewmethodofrapiddetection．MethodsSynthesistwoartificialantigenbyN—Hydroxy-suecinimidemethod，identificationbyFeCl3developingprocessandMAI．DI—TOF—MSmethod，determinatecouplingratioofthi

8、sartificialantigen．ImmuneantigenintraperitonealinjectionofBALB／Cmice，screeningspecificsecretionofenrofloxacinmonoclonalantibodiescelllinesandgetascitesbyhybridomaclonetechnology．Establishmentofenzyme—linkedimmunosorbentass