山新杨高效遗传转化体系的建立及蒙古柳fox山新杨抗性植株的获得

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1、万方数据学校代码：10225学号：B13029学位论文山新杨高效遗传转化体系的建立及蒙古柳FOX山新杨抗性植株的获得指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：韩雪柳参奎教授博士2013年3月东北林业大学学科专业：园林植物与观赏园艺论文答辩日期：2013年6月13日授予学位日期：2013年6月答辩委员会主席：论文评阅人：素必符素犬学万方数据DissertationfortheDegreeofDoctorEfficientAgrobacterium-·mediatedTransformationofPopulusdavidianaDode×PopulusbollenaL

2、aucheandtheObtainmentofResistanceSalixFOXPopulusCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：HanXueProf．LiuShenkuiDoctorOrmamentalPlantsandHorticulture13th，June，2013NortheastForestryUniversity9叭叭小^口一5凹燃一20叭m■l一23帅刚"-l0l咖m眦—‘●B㈣7

3、e：岫mmm，．●x㈣万方数据摘要杨树是木本植物的模式植物，其遗传转化机理、转化方法和转化范围已有深入研究，并取得了较大的发展，同时也获得了不同品种的转基因植株，但在杨树遗传转化过程中，实际上是在进行大量的重复实验后，而得到了的少数几个转化子。FOX-HuntingSystem技术，即Full-lengtheDNAO_Qver-eX_pressorgeneHuntingSystem(全长eDNA高效表达功能基因探索系统)，该方法通过把全长eDNA高效率地导入植物中，使其基因过量表达并导致表型发生变化，达到明确基因功能的目的。本文为将FOXhuntingsystem技术应用在木本植

4、物杨树中，建立高效率的杨树遗传转化体系具有现实意义。成功的植物基因转化首先需要依赖一个良好的再生体系的建立，而理想受体系统的建立则与植物的组织培养分不开。本文以山新杨(PopulusdavidianaDode×PopulusbollenaLauche)叶片为实验材料，建立了高效的山新杨再生体系，在此基础上，建立了一个高效的遗传转化体系。使用建立的山新杨高效的遗传转化体系，将已构建的蒙古柳cDNA农杆菌表达文库，转入山新杨中，获得了大量的蒙古柳FOX山新杨抗性植株，并对获得的大量的抗性植株进行耐盐碱性的初步筛选，获得了较为耐盐碱的转基因品种，为在木本植物中利用FOXhuntings

5、ystem技术筛选功能基因打下基础。具体实验结果如下：建立了一个高效的山新杨再生体系，为山新杨的遗传转化奠定基础。(1)以2％的NaCl0作为消毒剂，消毒不同的时间，筛选较好的消毒时间，结果显示使用2％的NaClo作为消毒剂，消毒15min可以达到较好的消毒效果。(2)使用6-BA(O．1，0．3，0．5mg／L)和NAA(0．01，O．03，O．05，0．08，0．1mg／L)两种激素进行不同浓度的组合，筛选出具有较高分化率的山新杨叶片分化培养基，结果显示，山新杨叶片在1／2MS+6-BA0．3mg／L+NAA0．08mg／L分化培养基上，具有最高的分化率，分化率达到90％以上

6、。(3)将分化出丛生芽的叶片外植体接种于含有6-BA(0．3，O．5，0．8mg／L)和NAA(O．05，O．1，0．15mg／L)两种激素进行不同浓度组合的壮苗培养基上进行壮苗，以提高生根率，筛选得到较优的壮苗培养基。实验结果表明最佳壮苗培养基为1／2MS+6-BA0．05mg／L+NAA0．1mg／L。(4)我们将分化出的丛生芽分成单芽，接种于含有不同浓度的NAA(0．1，O．2，0．25，0．3，0．4mg／L)培养基中，筛选较优的生根培养基，结果显示，山新杨芽在1／2MS+NAA0．25mg／L培养基中生根，生根率为100％，且根系粗细适中，万方数据摘要分根多且根系长势快

7、。(5)将在培养基中生根长大的山新杨组培苗进行炼苗和移栽，获得盆栽山新杨植株，移栽成活率达到90％以上。以高效的山新杨再生体系为基础，建立了一个高效的山新杨遗传转化体系，为获得大量的eDNA文库转基因植株提供成熟的技术。(1)卡那霉素(Kan)作为遗传转化过程中的筛选标记，对Kan的不同浓度进行筛选，选择较适合的浓度应用于遗传转化中。实验结果表明，30mg／L作为筛选培养山新杨叶片分化的筛选压较为合适；40mg／L作为山新杨生根筛选的适宜浓度。头孢噻亏钠(Cef)作为遗传转化中的