欧美杨组培体系的建立和Trx基因的遗传转化

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1、东北}^业J、学埘I学位沦上摘要本研究首先建立了欧美杨组培体系。通过实验研究建立了其组织培养和再生系统，通过此系统可在短期内获得大量扩繁植株，得出不同阶段最佳培养基与激素含量为：(1)再生芽诱导培养基：1／2MH+6-BA0．5mgrL-1+NAA0．05mgrL．1；(2)继代培养基：MH+6．BA0．5mg·L．1+NAA0．05mg·U1；(3)抽茎培养基：MH+6一BA0．1mg·L_1+NAA0．05mg-L1；(4)生根培养基：MH+IBAO．3mg·L1。然后将从抗旱、耐盐植物柽柳(Tamarixandrossowii)中克隆

2、得到的硫氧还蛋I刍(Thioredoxin，Trx)基因Trx，成功构建到酵母表达载体pYES2，并对其进行酿酒酵母的遗传转化，验证柽柳Trx基因的功能，同时将其构建到载体pROKll上并获得携带1’Ⅸ的植物表达载体，利用农杆菌介导法将Trx基因导入欧美杨基因组中，通过对转基因欧美杨的干旱胁迫试验，对硫氧还蛋白进行基因功能验证。将Tm基因与酵母表达载体pYES2连接，获得了pYES2—1h重组质粒。将pYES2．Trx转化酵母茵INVScI。随机挑选2个INVScl(pYES2-Trx)单菌落，经PCR扩增证明Trx基因已构建到pYES2载

3、体上。对1NVScl(pYES2-Trx)和INVSd(pYES2)菌株进行诱导，研究外源基因Trx在酵母中的的表达情况。重组酵母INVSel(pYES2-Trx)的NaCI、Na2C03、NaHC03、干旱，紫外线等胁迫实验证明，INVScl(pYES2．Trx)酵母的抗逆性明显高于对照INVScI(pYES2)菌株，实验结果说明在酵母受到逆境胁迫时，Trx基因表达的硫氧还蛋白对酵母细胞起到了保护作用，同时也证实了来源于柽柳的Trx基因具有提高真核生物抗逆性的功能。通过对欧美杨进行遗传转化，共获33株卡那霉素抗性芽，从中选出长势最优的10

4、个株系，进行PCR检测，结果均为阳性，初步证明Trx基因已整合到欧美杨基因组中：对lO个株系进行Northern杂交，其中7个株系出现杂交谱带，证明Trx转基因能够在这7株系中转录。分别对7个转基因株系进行了干旱胁迫试验，分析逆境胁迫条件下转基因欧美杨与非转基因对照欧美杨株系间丙二醛(MDA>含量、相对电导率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、叶绿素含量、相对生长量等指标的变化。结果表明，干旱胁迫处理8d时，转基因欧美杨相对电导率平均值低于对照欧美杨的9．17％；对照欧美杨MDA含量为30．015um01．91，而转基因欧美杨MDA含量大多在2

5、6IIt001．g_l左右，低于对照欧荚杨；此时转基因欧美杨的叶绿素平均含量为28．090mg．g一，高于对照的23．233％，而SOD平均活性高于对照的90．0％：对f旱胁迫8d时转基因株系相对生长量进行调查，各转基因株系相对生长量大于对照株系的相对生长量，说明硫氧还蛋自基因的导入提高了欧美杨的抗旱能力。综合以上：结果，硫氧还蛋白基因的组成型表达能够不同程度提高转基因欧美杨干旱胁迫下细胞膜稳定性、SOD活性、叶绿素含量及相对，￡长量。说明硫氧还蛋白基因具有提高植物抗旱性的功能。关键词欧美杨：硫氧还蛋白基因；遗传转化；干旱胁迫llIAbst

6、ractTissuecultureandregenerationsystemofPoplar(P口deltoides×P．nigra，‘shandisI’)wasestablishedinourexperiment．Plantgrowthregulatoralpha·naphthylaceticacid(NAA)andcelldivisionelement．6-animalpenaminopurine(6一BA)wereused，inourexperiment，toinducebudsandclumpshoots．1ndolebutyric

7、acid(IBA)wasusedforrootgenerationandgrowth．Thefollowingwasthemediaandhormoneusedinthepoplartissueculture：1／2MHculturemedium伯一BA0．5mg·olandNAA0．05mg-L-1)wasusedtoinduceandobtaintheregeneratedbuds；蛐culturemedium(6·BA0．5mg-L-1andNAA0．05mg·L1)wasusedtogenerateclumpbuds；删cultur

8、emedium(6-BAO．1mg-L-1andNAA0．05mg·L1)wasusedtoobtainstrongshoots；1／2Ⅲculturemedium(IBA0．3