杏鲍菇遗传转化体系的建立与pyrg基因的克隆

《杏鲍菇遗传转化体系的建立与pyrg基因的克隆》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河北农业大学硕士学位论文杏鲍菇遗传转化体系的建立与pyrG基因的克隆姓名：尹永刚申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：李明；刘宇20120602摘要杏鲍菇(Pleurotuseryngii(DC．Ex．Fr．)Qu61)是侧耳属的一种重要珍稀食用菌，具有很高的食药用、经济和生态学价值。杏鲍菇在消费者中的受欢迎程度及其年产量越来越高，然而目前以杏鲍菇为对象的分子生物学相关研究很少，在育种和生物技术研究中缺乏一种可靠的分子生物学工具。本研究目的在于建立高效的杏鲍菇遗传转化体系，它不仅可以促进其分子遗传学方面的研究，同时还可以开发一种具

2、有潜力的、新型的外源蛋白的表达系统。本研究首先克隆获得杏鲍菇内源gpd启动子和终止子，构建杏鲍菇表达载体pEPUGH，以液体培养的杏鲍菇单核菌丝为试验材料，获得具有再生活力的原生质体，采用PEG／CaCl2介导法转化原生质体，以使报告基因哆咖在杏鲍菇中获得表达；并通过巢式PCR和染色体步行技术克隆获得杏鲍菇pyrG基因，为今后杏鲍菇安全筛选标记转化系统的建立奠定基础。本研究得到以下结果：1．根据已报道的香菇gpd启动子与终止子序列设计引物，以单核杏鲍菇基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得杏鲍菇硼动子(1065bp)与终止子(988

3、bp)。2．以质粒pUCl9为出发载体，把杏鲍菇gpd启动子和gpd终止子分别插入连接到pUCl9的多克隆位点处，得到重组质粒pUPT；通过PCR扩增质粒pCSN44上携带的筛选标记基因hph，将其插入到含报告基因增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的质粒pEGFP．C1上，获得重组质粒pEGFP．hph；然后在此基础上设计引物，通过PCR扩增pEGFP．hph得到馏勿．hph融合基因，将其插入到载体pUPT的即掮动子与终止子之间，获得重组质粒pEPUGH，成功构建了含eg经。一hph融合基因的杏鲍菇表达载体。3．以0．6mol／L甘

4、露醇为原生质体释放稳渗剂，32℃酶解杏鲍菇菌丝体1．5h，成功制备杏鲍菇原生质体；通过杏鲍菇原生质体对潮霉素的抗性试验，确定杏鲍菇原生质体再生对潮霉素的最敏感浓度为60gg／mL。4．采用PEG介导法将质粒pEPUGH转化杏鲍菇的原生质体，随机获得了具有潮霉素抗性的假定转化子37个，其中12个转化子经PCR检测、PT-PCR验证、Southern杂交及Real．Time荧光定量PCR分析证实目的报告基因e施已成功转入杏鲍菇基因组中，转化效率为90-210个转化子／(斗gDNA·107个原生质体)，转化子在荧光倒置显微镜下可以观察到其

5、菌丝体发出的绿色荧光，成功建立杏鲍菇原生质体转化体系。5．通过将获得的杏鲍菇转化子和对照非转化杏鲍菇分别同时进行出菇试验，经过100天左右的培养，杏鲍菇转化子和对照杏鲍菇均可形成原基并正常出菇，且形态相近。6．通过巢式简并PCR技术扩增获得约300bp的矽)，rG保守序列，通过染色体步行技术克隆获得保守序列上游序列长672bp，下游序列长841bp。序列分析可矢NpyrGDNA序列全长920bp，其cDNA序列全长813bp，编码246个氨基酸。通过在NCBI上BLAST序列同源性比对，杏鲍菇pyrG基因编码的氨基酸序列与平菇、裂褶

6、菌和草菇分别有93．1％、59．1％和57．8％的相似性。关键词：杏鲍菇；原生质体；PEG介导法；eg砸v—hph融合基因；pyrGCloningofthepyrGGeneandEstablishmentofTransformationSystemofPleurotuseryngiiM．A伊．Candidate：YinYonggangSupervisor：Prof．LiMingProf．Liu妇Major：OlericultureStudyfield：Biotechnology&GenetieBreedinginEdibleFung

7、i(CollegeofHorticulture，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China)AbstractPleurotuseryngii(DC．Ex．Fr．)Qu61isakindofrarepreciousediblefunguswhichbelongstothePleurotaceae．111ismushroomhaShighlynutritional，pharmaceutical，economicandecologicalvalues．However,intheres

8、earchofmolecularbiologyofP．eryngii，fewrelevanttoolsareavailabletomeetthegrowingdemandforitsbreedingandbiotechnologica