猪肺炎支原体lamps诱导caspase3激活介导猪肺泡上皮细胞凋亡

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateApoptosisinducedbylipid-associatedmembraneproteinsfromMycoplasmahyopneumoniaeismediatedbycaspase3inSt.JudePorcineLungEpithelialCellLineCandidate:NiBoSupervisor:WeiJianzhongCooperantSupervirsor:ShaoGuoqingAcademicDegree

2、appliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventativeVeterinaryScienceResearchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalCollege:AnimalScienceandTechnologycollegeJune,2013摘要猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）是引起猪支原体肺炎（MycoplasmaPneumoniaeofSwine，MPS）的主要病原体，该病是一种慢性的呼吸道疾病，以咳嗽和气喘为主

3、要的临床症状，在肺心叶、膈叶、尖叶和中间叶前缘存在典型的虾肉样或肉样实变，该病具有发病率高而死亡率低的特点。支原体存在有一种重要的结构脂质相关膜蛋白（lipidassociatedmembraneproteins，LAMPs），在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。近些年，越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要作用。为探讨LAMPs在猪肺炎支原体致病性中的作用，进行了以下研究。首先建立了猪肺炎支原体LAMPs与猪肺泡上皮细胞SJPL相互作用的模型。使用Trion-X114从不同菌株的猪肺炎支原体培养物中提取LAMPs，

4、采用MTT法检测LAMPs对细胞生长的抑制率，并观察其对细胞生长状况的影响。研究证实不同菌株的LAMPs均可对SJPL细胞产生抑制作用，在光镜下细胞形态发生改变，死细胞数目随着LAMPs作用浓度的增大而增多。根据MTT法测定不同浓度LAMPs对细胞的抑制率数据计算得出IC50进行相互比较，结果显示5株猪肺炎支原体的LAMPs对SJPL细胞抑制作用的强度与猪肺炎支原体的毒力强弱基本相符，即NJ株，168株和XLW-1株的抑制作用较强，而168致弱株及J株对SJPL细胞的抑制作用较弱，其中NJ株的IC50最低为0.13mg/mL，XLW-1株

5、的IC50为0.2mg/mL，而J株的IC50最高为0.56mg/mL。在综合考虑了LAMPs对SJPL细胞的抑制作用，IC50和菌株本身的特性和生长状态后，决定在本研究中采用猪肺炎支原体XLW-1株所提取的LAMPs与SJPL细胞相互作用，IC500.2mg/mL为诱导凋亡的作用浓度。随后，通过DAPI，TUNEL，AO-EB和Annexin-V-PI检测确定LAMPs具有诱导SJPL细胞凋亡的作用。以IC50浓度0.2mg/mLXLW-1株所提取的LAMPs与SJPL细胞相互作用，在DAPI染色后可观察到SJPL细胞的染色体呈碎块状浓

6、染，细胞核皱缩，出现凋亡小体，由于基因组断裂而暴露出的3’-OH在TUNEL检测中呈现特异的绿色荧光，并且LAMPs诱导的凋亡细胞在AO-EB染色中与正常细胞相区别。通过流式细胞仪检测了LAMPs诱导SJPL细胞的凋亡率，0.2mg/mLLAMPs与SJPL细胞相互作用24h可引起36.5%±11.66%的细胞发生凋亡。为了进一步确定LAMPs诱导凋亡的调控机制和途径信号通路，实验中检测了caspase的活性，使用Westernblot检测一些信号蛋白以及Cytc。实验证实，LAMPs可以激活SJPL细胞中caspase3和caspase

7、8的活性，裂解PARP，磷酸化p38MAPK，表达促凋亡蛋白Bax的同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外，LAMPs还激活Cytc，使其从线粒体膜中释放出来，在胞浆中与FITC标记的抗体相结合，在荧光显微镜I下呈现特异的绿色荧光。在研究中，发现LAMPs可以刺激细胞产生NO和超氧化物，NO和超氧化物的浓度通过Griess试剂和WST检测，与LAMPs的浓度和作用时间相关。以0.5mg/mLLAMPs刺激SJPL细胞最高可产生20.13μMNO，以0.2mg/mLLAMPs作用于SJPL细胞60min产生超氧化物的最高量为阴性对照的3倍

8、。研究结果显示，5种不同菌株猪肺炎支原体所提取的LAMPs对SJPL细胞均存在抑制作用，抑制作用的强度与菌株毒力大小基本相符。使用XLW-1株所提取的LAMPs可以刺激SJPL细胞产生NO和超