绿色荧光蛋白表达重组巨细胞病毒构建及抗巨细胞病毒药物筛选

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：张些鱼日期：兰!里兰!兰关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或

2、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：毯魍鱼导师签名：隧日期尹丝￡苎：竺山东大学硕士学位论文绿色荧光蛋白表达的重组巨细胞病毒的构建及抗巨细胞病毒药物筛选专业：病原生物学硕士研究生：张晓梅导师：周亚滨副教授中文摘要人巨细胞病毒，属于疱疹病毒亚科，是自然界中普遍存在的病原体，大部分的巨细胞病毒感染是无临床症状的，但是可以在机体中长期潜伏存在，引起免疫缺陷者严重的疾病甚至死亡。近几年来，随着器官移植，免疫抑制

3、治疗，HIV感染者的增加，巨细胞病毒感染的影响越来越受到人们的重视。而且，巨细胞病毒感染也是引起新生儿出生缺陷的主要病原体之一。由于该病毒结构的复杂性，至今对于其确切的致病机理及机体对该病毒感染的保护性免疫反应仍知之甚少，治疗比较困难，有效药物并不多。近年来抗病毒的药物有了很大的发展，抗巨细胞病毒的常用药物的有更昔洛韦，西多福韦，磷甲酸等，但是存在口服药物生物效价低，药效差，一定的毒性以及耐药毒株的问题。随着医药基础理论的不断Iii『迸，基因工程的不断发展，通过广大医药工作者的不懈努力，新的抗病毒药

4、不断出现。我校药学院研究开发了一系列的抗巨细胞病毒的药物一噻吩并噻二嗪及其衍生物，与本课题组合作对其进行抗巨细胞病毒药物筛选。目前国内学者常用的抗病毒药物的筛选方法是细胞病变效应法(CPE法)，该方法需要的实验周期比较长，比较复杂，但是结果是肯定的。其他国外学者有用DNA杂交技术和流式细胞术检测抗原的方法，但是受到实验室条件和技术的限制。本课题利用分子生物学方法，构建绿色荧光蛋白的巨细胞病毒，建立了一种快速有效的抗巨细胞病毒的药物筛选方法，通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的作用，并拟将该重组病毒

5、进一步用于巨细胞病毒发病机制的研究。首先，将PHM673质粒转化入大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，扩增纯化后得到大量质粒，酶切鉴定，将质粒直线化，用脂质体转染法转入原代培养的人胚肺成纤维细胞，巨细胞病毒Towne标准株感染转染后细胞，G418筛选，空斑法纯化，PCR鉴定，获得携带绿色荧光蛋白的重组巨细胞病毒。将HCMV-Towne山东大学硕士学位论文标准株和／或重组HCMVo．owlle．GFP病毒感染人胚肺成纤维细胞，不同药物，不同药物浓度与病毒相互作用，采用传统的CPE法和检测重组病毒绿色荧光表

6、达两种不同的方法，进行抗巨细胞病毒药物的筛选。结果，我们成功构建携带绿色荧光蛋白的重组巨细胞病毒，重组后的病毒与HCMVTowne标准毒株相比，毒力无明显改变。将重组病毒感染人肚肺成纤维细胞，与待检药物相互作用，并用更昔洛韦作为对照。结果表明，药物的有效作用与重组病毒的绿色荧光表达量相一致，通过荧光倒置显微镜即可直接判定结果，不需要复杂的实验技术。而且绿色荧光蛋白的表达比CPE的出现早，因此与传统方法相比，绿色荧光表达的检测更为快速有效。由此得出结论，该重组病毒可以作为一种抗病毒药物的筛选工具。同时

7、证明，我校药学院研制的药物可以有效的抑制巨细胞病毒的感染，有着很好的发展前景，可以进行下一步的临床应用的研究。我们选择了一种中药．芪芍五味子合剂进行抗HCMV感染的检测，也证实该中药抗病毒有效，为中药治疗HCMV提供依据。关键词：人巨细胞病毒重组GFP药物筛选2山东大学硕士学位论文THECoNSTRUCTIONoFRECOMBINANTGREENFLUORESCENTPROTEIN．EXPRESSINGHUMANCYTOMEGAL0ⅥRUSANDATOOLFORSCREENINGOFANTIⅥRAL

8、AGENTSMajor：MicrobiologyPostgraduateZhangxiaomeiTutorAsso．Prof．ZhouyabinABSTRACTHumancytomegalovims(HCMV)，amemberofthebetaherpesvirinaesubfamily，isawidespreadpathogenresponsibleforgenerallyasymptomaticandpersistentinfectionsinhealthypeo