il-10基因修饰骨髓间充质干／祖细胞治疗小鼠急性移植物抗宿主病模型的疗效观察及机制研究

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1、-338·生堡速堂杂志2010年5月第31卷第5期ChinJHematol，May2010，Vo1．31，No．5·短篇论著·IL一10基因修饰骨髓间充质干／祖细胞治疗小鼠急性移植物抗宿主病模型的疗效观察及机制研究陈峰吴德沛孙爱宁符粤文常惠荣冯宇锋朱子玲朱明清李佩霞陈列松阮长耿问充质干细胞(MSC)除在造血微环境的形成及造血调完全培养基重悬，1×10。／ml密度接种，37℃、5％CO、饱和控(如促进造血干细胞归巢及定植等)中起重要作用外，近年湿度条件下培养。24h后换液，去除未贴壁细胞，此后每3d其免疫学特

2、性也颇受重视。有报道显示MSC可减低移植物换液1次。镜下贴壁细胞70％～80％融合时，0．05％胰酶．抗宿主病(GVHD)发生率及严重程度”。，但部分Ⅱ期研究0．02％EDTA消化，以(2．5～5．0)×10／ml密度接种传代。与体外及动物实验的结论并不一致。除偏倚因素外，也提示2．对不同代数的培养细胞进行如下检测：镜下形态学观MSC诱导移植免疫耐受的效应可能有限。白细胞介素l0察；小鼠成纤维细胞样集落形成单位(CFU—F)检测；细胞生(IL一10)可抑制T淋巴细胞和单核一巨噬细胞等炎症细胞的激长曲线及倍增

3、时间；细胞周期检测；细胞表面标记检测；体外活及多种炎症因子的合成，下调Thl型细胞反应。我们设计定向诱导成骨、成脂肪、成软骨分化。将IL一10基因修饰的间充质干／祖细胞(MSC／MPC)共移植于四、重组IL一10复制缺陷型腺病毒载体的构建、制备及体小鼠H-2单倍型急性GVHD(aGVHD)模型，观察其免疫生物外转染MSC／MPC学效应，从存活时间、死亡率、造血植入时间、嵌合情况、Ad5一miLl0腺病毒载体构建及制备参见文献[3]，确定aGVHD临床评分、组织病理改变及经典细胞因子水平等诸转染MSC／MPC

4、的最宜感染复数(MOI)，进行体外转染；RT—方面进行分析，为探讨基因修饰MSC建立免疫耐受的可行PCR法检测转染细胞IL一10mRNA表达，EHSA法检测转染性提供实验依据。细胞培养上清IL一10。五、IL一10基因修饰骨髓MSC／MPC在小鼠aGVHD模型材料和方法中的生物免疫学效应观察1．建立小鼠H一2单倍型骨髓移植aGVHD模型：以雄性一、实验动物F1(CB6F1)鼠为受鼠，接受直线加速器6mVX射线一次性C57BL／6小鼠(H一2K)，6～8周龄；BALB／c小鼠(H一全身照射(总剂量12Gy，剂

5、量率10(9cGy／min)。无菌条件下2K)，6～8周龄(购自上海斯莱克实验动物有限公司)；F1制备供鼠(雌性C57BL／6鼠)1：0、1：1、1：2及1：3四种比例(CB6F1)小鼠(H一2K)，8～9周龄，由C57BL／6与BALB／c的骨髓单个核细胞(MNC)和脾MNC混合悬液(骨髓MNC小鼠自行杂交制备，均为SPF级饲养。取1×10)，每种比例为一实验组(每组10只小鼠)。受鼠照二、主要试剂射后4h内经尾静脉输注相应混合悬液，继续SPF级饲养并MSC基础培养基及MSC刺激添加剂购自加拿大Stem—

6、进行下述观察及检测：CellTechnologies公司。FITC一抗小鼠CD29、CD31、Ly-6A／E(1)～般情况：每日观察小鼠一般状况、体态、毛发、饮(Sca一1)，PE一抗小鼠CD44(Pgp一1)、CD45(LCA)、CD105(En—食、活动、排便等，并定期称重。doglin)、H一2K单抗及相应Ig同型对照均购自美国BD公司。(2)外周血常规检测：移植后(+)3d始隔日采静脉血小鼠ELISA检测试剂盒(IL4、IL一10、IFN一及TNF—Ot)购自奥手工计数，稳定于正常水平后改为每周1次

7、。地利BenderMedsystems公司。(3)嵌合体检测：各组在+14、+21、+35d随机取小鼠三、小鼠骨髓MSC／MPC体外培养及生物学鉴定制备脾MNC悬液，加入PE标记抗小鼠H一2K单抗及Ig同型1．无菌条件下剥离雌性C57BL／6小鼠股骨及胫骨，以培对照，避光室温孵育，采用流式细胞术检测。以C57BL／6小养基反复冲洗骨髓腔，制备单细胞悬液。以Mesencuh鼠(H一2K)为阴性对照，CB6F1小鼠(H-2K)为阳性对照。(4)GVHD临床评分：记录存活时间、体重变化，监测DOI：10．3760

8、／cma．j．issn．0253-2727．2010．05．014GVHD征象，包括脱毛面积、毛发变化、活动状态、弓背体态、基金项目：江苏省医学领军人才培养基金(LJ200626)纳差、腹泻程度等；GVHD临床评分参照文献[4]，每项参数作者单位：215006苏州大学附属第一医院血液科、江苏省血按正常、轻、中、较重、重度改变分别评为0、0．5、1．0、1．5、2．0液研究所；卫生部血栓与止血重点实验室(陈峰、吴德