survivin基因启动子驱动trail诱导肝癌细胞凋亡

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1、硕士学位论文Survivin基因启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡硕士研究生：陈培生指导老师：陈村龙教授程天明副教授摘要背景肝癌是常见的恶性肿瘤之～，目前主要的治疗方法以手术、介入、放疗为主，而基因治疗有可能成为肝癌治疗的新手段。在肿瘤的基因治疗研究中，关键问题在于提高目的基因的靶向性。利用在多数肿瘤中特异性表达的启动子序列，驱动目的基因特异地在肿瘤细胞中表达，是解决肿瘤基因治疗靶向性问题的一个有效途径【l】。survivin是IAP家族的新成员。Survivin组织分布的最大特点是具有明显的细胞选择性，其在胚胎及多

2、种肿瘤细胞系中高表达【2】，但是不表达于终末分化的正常组织【31。因此，研究者认为survivin启动子可用作肿瘤靶向治疗的工具，启动下游杀伤基因特异性表达于肿瘤细胞，从而避免损伤正常细胞。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)又称为Ap02L(1igand)，是Wiley发现的TNF超家族成员【41，Trail的最大特点是能够诱导多种肿瘤细胞及转化细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响，而这一选择性杀伤特性也预示着碱l在

3、肿瘤治疗中有广泛的应用前景【5】o本研究我们拟构建含有Survivin340启动子及Trail全长cDNA的重组质粒。评价其在肿瘤细胞和正常细胞中诱导蛋白表达能力的差异以及诱导肿瘤细胞凋亡的情况。目的克隆人TrailcDNA基因和Survivin基因启动子，构建重组质粒I中文摘要pcDNA3．1／SurP／Trail，检测Survivin基因启动子在肿瘤细胞与正常细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异，并进一步检测重组质粒pcDNA3．1／SurP／Trail诱导肝癌细胞凋亡的情况。材料和方法1、主要材料：肝癌细胞株H

4、epG2细胞，小鼠胚胎正常成纤维细胞3T3细胞，真核表达质粒pcDNA3．1(-)，pluc340质粒(含有survivin特异启动子的pGL3载体)，大肠杆菌TOPl0感受态细胞。2、方法：2．1引物设计根据Trail及Survivin340启动子基因序列，分别设计了2对引物。Trail基I园上游引物：5’．TCCGCTCGAGCCTCACTGACT芦江AAAAGAATAGAG．3’包含了XhoI酶切位点：下游引物：5'-CCC丛Q￡I!GGGTlrAGCCAACTAA舭～GGCC．3’包含了HindIII酶切位点。

5、用该对引物扩增的PCR产物预期目的片段长度为955bp。Survivin启动子基因上游引物5‘一GA△鱼堑￡!TCTcAAGTGATGCTCCTGCCTA-3’包含了BglII的酶切位点，下游引物5'-TCCG￡至￡鱼△QTGTAGAGATGCGGTGGTCCT-3’包含了XhoI的酶切位点。用该对引物扩增的PCR产物预期目的片段长度为423bp。2．2Trail基因真核表达质粒的构建HepG2肝癌细胞(由本室常规培养保存)用含有100mL／L新生牛血清的RMPll640培养液常规培养。用Trizol(TaKaRa公司

6、产品)提取总RNA，逆转录反应按试剂盒(fermentas公司)说明操作制备eDNA。取21．tleDNA用上游弓l物和下游引物进行PCR反应。反应条件：预变性94℃15s，变性94*(230s，退火53"C30s，延伸68℃75s，32个循环，终末延伸68℃5min。所得目的片段用限制性核酸内切酶XhoI和HindIII双酶切后插入pcDNA3．1(．)的XhoI和HindlII多克隆位点之间，所得质粒命名为pcDNA3．1／Trail，进行测序。2．3含有Survivin340启动子的重组质粒构建II硕士学位论文克

7、隆Survivin340启动子基因，以pluc340为模板(本实验室保存)，利用上下游引物进行PCR反应，扩增条件如下：预变性94"(215s，变性94"C30s，退火56．5"030s，延伸689C75s，30个循环，终末延伸68。C5min。对所得目的片段及之前构建好的重组载体pcDNA3．1／Trail分别用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切，将酶切后产物纯化后用T4连接酶进行连接，所得质粒命名为pcDNA3．1／SurP／Trail，进行测序。2．4脂质体的转染在转染前一天，将HepG2细胞与3T3细胞两组

8、细胞分别转至6孔培养板中，浓度为2x105个／ml。当细胞融合约80％，用lipofectamine—LTX转染试剂盒将已构建好的重组质粒pcDNA3．1／SurP／Trail导入HepG2及3I"3细胞中。转染72小时提取两组细胞的总蛋白，用WesternBlot检测两组细胞Trail蛋白表达的差异。2．5重组质粒的鉴定用细胞裂