ires序列连接人gdnf基因和egfp基因逆转录病毒真核表达载体构建

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1、保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：>一山东太学硕士学位论文RES序列连接的人GDNF基因和EGFP基因逆转录病毒真核表达载体的构建中文摘要目的：克隆人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)全长基因，与连接有IRES2-EGFP的逆转录病毒载体pLXSN相连，构建逆转录病毒真核细胞表达载体，为治疗帕金森氏病、脑血管病等神经系统疾病奠定基础。方法：①从人脑胶质细胞瘤组织中提取总RNA，参照分子克隆指南，合成cDNA第l、2链，加入引物PCR扩增目的基因，得到558bp的目的片段后，克隆到p

2、MDl8-T载体中，得到重组pMDIST--GDNF。②同样方法扩增IERS2-EGFP基因片段，克隆到pMDl8-T载体中，得到重组pMDl8T-IRES2-EGFP。③分别对pMDl8T-GDNF，pMDl8T-IRES2-EGFP，pLXSN逆转录病毒载体进行酶切、连接，构建表达质粒。④对重组质粒进行酶切鉴定并测序验证。⑤将测序后的逆转录病毒重组质粒以电穿孔的方法，转入包装细胞PT67表达，流式细胞仪及荧光显微镜下观察转染效率。结果：提取的总RNA反转录cDNA后，PCR扩增的GDNF目的基因为500～600bp，

3、IRES2一EGFP基因片段，PCR扩增的目的基因为1200～1500bP，经酶切鉴定和序列鉴定分析，分别得到558bp和1308bp的序列，与Genebank做对照，发现IRES2--EGFP的片段上IRES2序列上有一个碱基突变，单它不会影响到后期荧光蛋白表达．GDNF与Genebank上发布的636bp条带相比，缺失了78个碱基，参考相关文献，此缺失78碱基的基因片段仍保留原蛋白的功能，是蛋白选择性剪切的结果，并且进一步测序发现，在此基因片段前蛋白的序列上出现了一个碱基突变，经过查证，属于同义突变，故不影响蛋白质的

4、表达，表明GDNF基因和IRES2一EGFP基因克隆成功，酶切鉴定结果与预期设想一致。电转染PT67细胞后，经绿色荧光显微镜观察和流式细胞仪测定发现，转染后PT67细胞在荧光显微镜下经蓝光激发，可以观察到大量的PT67细胞胞浆内呈现绿色荧光，同时做流式细胞仪测定转染效率，结果约为24．4％，提示EGFP基因及GDNF基因的进一步表达，说明目的基因片段已成功转入包装细胞内。结论：①利用分子生物学技术，完整地克隆了人GDNF基因全序列，通过测序加以验证，表明该片段符合人完整的GDNF基因片段序列并将人GDNF基因连接于含IR

5、ES2-EGFP2、}●‘，j-々1’、山东文学硕士学位论文的pLXSN逆转录病毒载体中．②通过电转染的方式，将IRES—EGFP-GDNF基因片段转入包装细胞PT67，可观察到EGFP基因及GDNF基因的表达，目的基因片段已成功转入包装细胞内，成功构建了真核细胞重组质粒，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床的基因治疗研究奠定了基础。@逆转录病毒载体pLXSN具有，可以避免整合基因的重排问题、对DNA合成活跃的快速分裂细胞具有很高的转染效率、在子代细胞中形成稳定的基因表达等优点。是符合我们实验的要

6、求优良载体。@EGFP不用加任何底物，荧光性质稳定；分子量小，对细胞无毒性；使用方便，可行活细胞实时定位观察，是一种很有价值的报告基因。为下一步转染骨髓间充质干细胞后移植治疗帕金森氏鼠模型做准备。关键词：胶质细胞源性神经营养因子；基因序列；逆转录病毒；绿色荧光蛋白；IRES序列L，；f-●；f-1电-山东土学碛-4位论文CONSTRUCTIONOFHUM,aNGLIALCELLLINEDERWEDNEUROTROPHICFACTORGENEANDENHANCEDGREENFLUORESCENCEPROTEINGENEBY

7、RETROVIRALVECTORCONTAININGINTERNALRIBOSOMEENTRYSITESEQUENCEAbstractObjectives：Toclonehumanglialcellline—derivedneurotrophicfactor(GDNF)totalgeneandcombinewithRetroviralvectorpLXSNwhichcontainedInternalRibsomeEntrySite(IRES)SequenceandEGFPgenesequencetoconstructex

8、pressionplasmidforprokaryoticcell，tomakepreparationsfortreatmentofnervoussystemdiseaseincludingParkinson’sdisease，cerebrovasculardiseaseandsoon．Methods：廷)Total