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时间:2019-03-08
《ires序列连接人gdnf基因和egfp基因逆转录病毒真核表达载体构建》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名:>一山东太学硕士学位论文RES序列连接的人GDNF基因和EGFP基因逆转录病毒真核表达载体的构建中文摘要目的:克隆人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)全长基因,与连接有IRES2-EGFP的逆转录病毒载体pLXSN相连,构建逆转录病毒真核细胞表达载体,为治疗帕金森氏病、脑血管病等神经系统疾病奠定基础。方法:①从人脑胶质细胞瘤组织中提取总RNA,参照分子克隆指南,合成cDNA第l、2链,加入引物PCR扩增目的基因,得到558bp的目的片段后,克隆到p
2、MDl8-T载体中,得到重组pMDIST--GDNF。②同样方法扩增IERS2-EGFP基因片段,克隆到pMDl8-T载体中,得到重组pMDl8T-IRES2-EGFP。③分别对pMDl8T-GDNF,pMDl8T-IRES2-EGFP,pLXSN逆转录病毒载体进行酶切、连接,构建表达质粒。④对重组质粒进行酶切鉴定并测序验证。⑤将测序后的逆转录病毒重组质粒以电穿孔的方法,转入包装细胞PT67表达,流式细胞仪及荧光显微镜下观察转染效率。结果:提取的总RNA反转录cDNA后,PCR扩增的GDNF目的基因为500~600bp,
3、IRES2一EGFP基因片段,PCR扩增的目的基因为1200~1500bP,经酶切鉴定和序列鉴定分析,分别得到558bp和1308bp的序列,与Genebank做对照,发现IRES2--EGFP的片段上IRES2序列上有一个碱基突变,单它不会影响到后期荧光蛋白表达.GDNF与Genebank上发布的636bp条带相比,缺失了78个碱基,参考相关文献,此缺失78碱基的基因片段仍保留原蛋白的功能,是蛋白选择性剪切的结果,并且进一步测序发现,在此基因片段前蛋白的序列上出现了一个碱基突变,经过查证,属于同义突变,故不影响蛋白质的
4、表达,表明GDNF基因和IRES2一EGFP基因克隆成功,酶切鉴定结果与预期设想一致。电转染PT67细胞后,经绿色荧光显微镜观察和流式细胞仪测定发现,转染后PT67细胞在荧光显微镜下经蓝光激发,可以观察到大量的PT67细胞胞浆内呈现绿色荧光,同时做流式细胞仪测定转染效率,结果约为24.4%,提示EGFP基因及GDNF基因的进一步表达,说明目的基因片段已成功转入包装细胞内。结论:①利用分子生物学技术,完整地克隆了人GDNF基因全序列,通过测序加以验证,表明该片段符合人完整的GDNF基因片段序列并将人GDNF基因连接于含IR
5、ES2-EGFP2、}●‘,j-々1’、山东文学硕士学位论文的pLXSN逆转录病毒载体中.②通过电转染的方式,将IRES—EGFP-GDNF基因片段转入包装细胞PT67,可观察到EGFP基因及GDNF基因的表达,目的基因片段已成功转入包装细胞内,成功构建了真核细胞重组质粒,为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床的基因治疗研究奠定了基础。@逆转录病毒载体pLXSN具有,可以避免整合基因的重排问题、对DNA合成活跃的快速分裂细胞具有很高的转染效率、在子代细胞中形成稳定的基因表达等优点。是符合我们实验的要
6、求优良载体。@EGFP不用加任何底物,荧光性质稳定;分子量小,对细胞无毒性;使用方便,可行活细胞实时定位观察,是一种很有价值的报告基因。为下一步转染骨髓间充质干细胞后移植治疗帕金森氏鼠模型做准备。关键词:胶质细胞源性神经营养因子;基因序列;逆转录病毒;绿色荧光蛋白;IRES序列L,;f-●;f-1电-山东土学碛-4位论文CONSTRUCTIONOFHUM,aNGLIALCELLLINEDERWEDNEUROTROPHICFACTORGENEANDENHANCEDGREENFLUORESCENCEPROTEINGENEBY
7、RETROVIRALVECTORCONTAININGINTERNALRIBOSOMEENTRYSITESEQUENCEAbstractObjectives:Toclonehumanglialcellline—derivedneurotrophicfactor(GDNF)totalgeneandcombinewithRetroviralvectorpLXSNwhichcontainedInternalRibsomeEntrySite(IRES)SequenceandEGFPgenesequencetoconstructex
8、pressionplasmidforprokaryoticcell,tomakepreparationsfortreatmentofnervoussystemdiseaseincludingParkinson’sdisease,cerebrovasculardiseaseandsoon.Methods:廷)Total
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