临床医学毕业论文重组人gdnf基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达.doc

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1、XX大学毕业论文重组人砂壓基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达2014年6月25日重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达作者：陈睿刘雪平郭春红孙志军【摘要】n的构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体，将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞屮的表达。方法PCR法扩增GDNF基因及IRES2EGFP基因，测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接，构建重组逆转录病毒质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoRI酶切鉴定重组质粒。脂质体Lipofectamine2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病

2、毒滴度。流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达。结果PCR扩增得到大小约558bp和1308bp的特异性条带，测序证实，获得正确的人GDNF序列和EGFP序列。经EcoRI酶切鉴定，成功构建重组质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达，流式细胞仪检测转染效率为24.4%。结论正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF质粒。基因转染包装细胞PT67获良好表达。【关键词】胶质细胞源性神经营养因子；逆转录病毒；脂质体；基因转染帕金森病(PD)临床疗效不佳，有学者将骨髓间充质干细胞(MSCs)定向移植入P

3、D鼠模型的黑质纹状体区，发现其能够存活并分化为酪氨酸疑化稱(TyrosineHydroxylase,TH)表型神经元，从而改善PD大鼠症状，但不能阻止神经细胞的进一步死广。于是有学者探索将神经营养因子体外转染靶细胞，通过立体定向的方式移植入鼠的黑质纹状体区，发现可促进PD大鼠的黑质纹状体神经通路的结构和功能的恢复。本课题拟在以上研究的基础上，应用人胶质细胞源性神经营养因子(glialcelllinederivedneurotrophicfactor,GDNF)重组逆转录病毒体外转染MSCs,立体定向移植入PD大鼠模型的黑质纹状体区，通过对和应指标的测定,分析逆转录病毒介导GDNF基因转染MSC

4、s移植治疗PD的可行性及其疗效。本文为实验的第一部分，旨在构建一个携带有治疗基因GDNF同时携带报告基因加强型绿色荧光蛋口(enhancegreenfluorescentprotein,EGFP)的逆转录病毒重组质粒，转染包装细胞PT67后，检测棊因的表达及转染效率，为下一步转染MSCs、进一步深入探讨GDNF基因在神经系统疾病基因治疗屮的作用萸定基础。1材料与方法1.1材料、试剂和仪器人神经胶质细胞瘤标本，由山东省立医院神经外科提供。逆转录病毒载体pLXSN质粒、携带pIRES2EGFP基因片段的质粒、PT67、NIH3T3细胞由山东省立医院屮心实验室保存并提供。PCR试剂盒、pMD18T载

5、体试剂盒、限制性内切酶XhoI>BamHLBglII、EcoRI>T4连接酶均购自大连TAKARA公司；屮量质粒抽提试剂盒购自Omega公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亚生物技术有限公司合成；Lipofectamine2000.OptiMEM无血清培养基购自Invitrogen公司；G418、DMEM培养液购自Gibco公司；Polybrene购自Sigma公司。1.2方法1.2.1GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及测序参照《分子克隆实验指南》，从人神经胶质细胞瘤组织屮提取总RNA后逆转录生成eDNAo以eDNA为模板，PCR扩增GDNF基因

6、片段。同吋，以含有hES2序列及EGFP基因片段的质粒为模板，PCR扩增EGFP基因片段。扩增程序：94°C5min；94°C30s,65°C30s,72°C1min,10个循环；94°C30s,55°C30s,72°C1min,20个循环；72°C7min充分延伸；4°C,保持。GDNF基因引物序列(上游亍TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3下游5’CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC39；IRES2EGFP基因引物序列(丄游5’TTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3',下游5'CGGGA

7、TCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3，)。引物设计吋分别引入XhoI、BamHI、BgIII酶切位点。扩增产物纯化回收后克隆入T载体，筛选阳性克隆，使用测序仪进行测序。1.2.1pLXSNIRES2EGFPGDNF重组体的构建及鉴定XhoI和BamHI分别双iW切pLXSN质粒及pIRES2EGFP,T4连接酶连接酶切后产物，得到pLXSNIRES2EGFP；XhoI和Bgl11分