bmp-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中作用

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1、B肝一7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用硕士研究生：李正指导老师：吴文摘要【研究背景和目的】骨质疏松(Osteoporosis)主要是由于骨吸收与骨形成之间的平衡被打破，骨吸收量大于骨形成量，从而引起骨量减少的一种疾病。一般认为，破骨细胞活性增强，导致骨吸收增加，是形成骨质疏松的重要原因。骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)在特定的诱导条件下，可以向不同的细胞方向分化，包括成骨细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。鉴于BMSCs

2、具有定向成骨分化的潜能，骨髓间充质干细胞也成为人工骨材料的主要来源之一。BMSCs的研究也逐渐引起人们的关注。BMSCs成骨转化过程中有多种成骨标志物，其中碱性磷酸酶(ALP)活性的提高是成骨分化的重要标志之一，另外ALP也参与成骨细胞的结节钙化。骨形态蛋白(Bonemorphogeneticprotein，BMP)是多功能生长因子，属于转化生长因子．p(TGF．D)超家族，是一组具有类似结构的保守的功能蛋白组成，能够在体内诱导骨和软骨形成，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期软骨修复及骨骼的胚胎发育和再

3、生修复等方面起重要作用。已知的已经被克隆出的BMPcDNA有17种，目前的研究表明能有效地促进BMSCs向成骨细胞分化，诱导骨的形成的BMP主要是BMP2／3／4／5／7。BMP．7是骨形态发生蛋白家族中的一员，主要在骨组织和肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表摘要达。研究发现BMP．7在自体骨表面可以生成关节软骨面，还可以在某些特定的环境下修复软骨、肌腱和韧带。国内外研究表明给予外源性BMP．7可促进BMSCs向成骨转化。国外研究表明应用BMP．7治疗骨损伤的治愈率明显高于对照组。因此BMP

4、．7作为促进骨形成的重要骨形成蛋白因子，引起越来越多人的关注。Osterix(OSX)是最新由Nakashima等人发现的一种含锌指结构的转录因子，属于Sp／XKLF家族，它是一个由428个氨基酸组成的蛋白质，研究表明OSX蛋白分布于细胞核中，其作用与组织的分化成熟密切相关。在OSX基因剔除的小鼠胚胎中，膜性骨骼的致密间充质和软骨内骨骼的骨膜及间充质中，成骨细胞分化的各种标志物的表达水平严重降低或者缺如，可见成骨细胞的分化被完全阻断。OSX基因剔除细胞可表达软骨细胞的特征性标志物，因此OSX可能具有抑制

5、骨／软骨祖细胞向软骨细胞分化的功能。雷奈酸锶(Strontiumranelate，Sr)是新型的抗骨质疏松药物，具有促进骨形成，抑制骨吸收的作用，它能保护去卵巢大鼠的骨流失，并且可促进成骨细胞ALP活性的表达。给予sr治疗能明显促进成骨细胞转录因子水平的增高。此外越来越多的研究者关注分子水平上sr促进骨形成的机制。本实验通过观察BMSCs成骨细胞转化过程中ALP、BMP．7、钙结节、OSX基因表达，探讨Sr促进骨形成的作用。通过添加BMP．7阻断剂noggin观察Sr促进骨形成过程中ALP、BMP．7、

6、钙结节、OSX基因表达的变化，探讨Sr促进BMSCs向成骨细胞转化过程BMP．7所起作用，为临床上应用sr防治骨质疏松等疾病提供新颖的实验依据。【实验方法】1、SD大鼠骨髓间充质干细胞培养本实验拟采用步骤相对简单的全骨髓贴壁法将BMSCs从骨髓中分离出来，并在体外进行培养和扩增，倒置显微镜下观察其增殖和生长特性。以此建立一套稳定有效、重复性好的BMSCs体外分离、培养和扩增的方法。并取生长良好的第3"4代BMSCs用做实验。2、分别用细胞碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、免疫印迹法(WestemH硕士学位论

7、文blotting)、逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度Sr作用下ALP活性的表达、钙结节的表达、BMP．7的表达水平及特异转录因子OSX基因的表达情况；相同浓度sr作用不同时间作用下BMP．7及OSX基因的表达情况。3、加入BMP·7阻断剂noggin预处理BMSCs2小时后再加入sr处理培养细胞并用碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、Westernblotting方法、RT-PCR方法检测对照组及各实验组的ALP活性、钙结节的表达、BMP．7及OSX基因的表达情况。4、统计学方法：计量资料数

8、据以均数x±S表示，应用SPSSl7．0统计软件进行统计学分析，结果可采用两独立样本T检验和单因素方差分析(One．wayANOVA)方法，方差齐性用LSD法进行组间多重比较，方差不齐时用Dunnet-t检验。P<0．05被定为有统计学差异。【实验结果】1．细胞学形态观察细胞接种后随即在倒置显微镜下观察，培养液中存在着很多大小不等的圆形细胞，其中造血细胞为主要成分。原代BMSCs接种24小时，仅见少量贴壁细胞，近似圆形或短梭形，48小时贴壁