含mk启动子腺病毒载体构建基础的研究

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1、大连医科大学硕士学位论文含MK启动子腺病毒载体构建的基础研究姓名：韩秀敏申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：张阳20040601含MK启动子腺病毒载体构建的基础研究硕士研究生：韩秀敏指导教师：张阳教授指导小组：孟夏博士叶迅博士专业名称：肿瘤学摘要基因治疗指将外源性遗传物质导入机体靶细胞而治疗疾病的方法。基因治疗载体难以有效的靶向所有肿瘤细胞以及治疗基因难以高水平地表达一直是基因治疗的最大障碍。近年来提出了靶向性基因治疗的概念，即通过修饰载体和目的基因使得重组的病毒载体有选择地攻击肿瘤细胞，而减轻对正常组织的毒

2、副作用。其中，载体的构建最为关键。腺病毒是目前使用得最为广泛的基因治疗载体之一，但现应用于临床试验的基因工程腺病毒制剂临床疗效有限，靶向性不高。本项研究采用基因工程方法，对人的5型腺病毒的基因进行改造，在目前现有的溶瘤性腺病毒的基础上，插入特异性启动子MK和目的基因E1A，使得构建的腺病毒载体只能在表达MK的肿瘤细胞中复制、增殖，发挥溶瘤作用；插入的目的基因E1A又具有多种抗肿瘤活性。因此，构建的腺病毒载体既具有很强的肿瘤靶向性，又具有良好的抗肿瘤活性。方法：实验主要采用同源重组的方法进行腺病毒载体的构建，具体包

3、括如下几个过程：目的片段MK--AP--IRES—E1AⅡl的获取、连接、筛选：目的片段插入Pshuttle质粒中：含目的片段的Pshuttle质粒与pAdEasyl同源重组：重组腺病毒转染至人胚肾细胞HEK293细胞中；转染后病毒的检测。结果：应用同源重组的方法可以构建含MK启动子和目的基因E1A的腺病毒载体；通过酶切鉴定，证实获得了含MK启动子，E1A基因的阳性重组腺病毒DNA，该重组腺病毒可转染HEK293细胞，并能在HEK293细胞中进行有效复制。结论：成功构建了含MK启动子的条件复制腺病毒载体，为进一步

4、研究该腺病毒的功能提供了条件。关键词：MKE1A腺病毒同源重组肿瘤ConstructionofConditionallyReplicatingAdenovirusesDrivenbyMKPromoterPostgraduate：HanXiuminSupervisor：Prof．ZhangYangSupervisinggroup：Doe．MengXiaDoe．YexunSpeciality：OneologyGenetherapy,bydefinition，utilizesdirectedgeneWansfertot

5、reatdisease．Thefirstclinicalgenetherapystudyforcanceremerged10yearsago．Earlyresultsontheclinicalefficacyofgene+therapiesweresomewhatdisappointing．Thissetbackislargelyduetothelackofefficientandadequategenetransfervehicles．Withtherecentprogressinelucidatingthem

6、olecularmechanismofhumandiseasesandtheimminentarrivalofthepostgenomicera,thereareincreasingnumbersoftherapeuticgenesthatareavailable-forgenetherapy．ThecurrentfundamentalobstacleistOdevelopdeliveryvectorsthatexhibithighefficacyandspecificityofgenetransfer．Reco

7、mbinantadenoviruseshaveprovidedaversatilesystemforgeneexpressionstudiesandtherapeuticapplications．Recentendeavorsinthedevelopmentofrecombinantadenoviralvectorshavefocusedonmodificationofviruses，increaseinstabilityandcontroloftransgeneexpression．ByusingAdEasys

8、ystem,whichisbasedonthehomologousrecombinationinbacteria,anAP(alkalinephosphatase)dabledrecombinantadenovimsvectorcontainingadenovirusE1AdrivenbyMKpromoterWasconstructed．Byendonucleasedig