小麦根tanrt2.1基因抗原决定簇片段和原核表达载体构建及在e.coli中诱导和纯化

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1、首都师范大学硕士学位论文摘要近年来，许多硝酸盐高亲和力转运体基因在真核生物中被克隆出来，例如欧洲油菜的BnNRT2、烟草的NRT2．INp、拟南芥的AtNRT2．』和AtNRT2．2、大豆的G，，l^氓力、大麦的BC刖和BCH2以及番茄的LeNrtl．J和LeNrtl一2等。本课题的最终目的是对我们实验室所克隆的小麦硝酸盐高亲和力转运体基因TaNRT2．，的蛋白产物进行亚细胞定位。根据TaNRT2．』所编码的氨基酸序列。利用软件分析得到了其中一段抗原性最强的片段。通过采用大肠杆菌偏爱的密码子，对该氨基酸序列进行人工设计并

2、合成，该片段被命名为Ag。本论文的前期工作进行得很顺利，将Ag游段克隆到融合蛋白表达载体pGEX．2T上，成功构建了pGEX-2T-Ag重组质粒，经IPTG诱导后也成功地表达了目的融合蛋白。为制备抗体进行各细胞器蛋白的Westem杂交打下基础。该载体含有一个谷胱甘肽．S．转移酶(GSD基因，便于融合蛋白表达后的纯化，而且在GST的后部有一个凝血酶的酶切位点，有利于将目的蛋白从融合蛋白上切割下来。这时遇到了一个难题：融合蛋白由于表达量过高而形成了不溶性的包涵体沉淀，导致无法纯化融合蛋白。经过多种途径的尝试，仍未解决这个问题

3、。同时，我充分利用网络资源，深入分析并预测了TaNRT2．1的各种性质，通过多种途径得到了一个相同的结论：TaNRT2．1是膜蛋白，共有12个跨膜螺旋。也深入分析了其氨基酸组成，并对其二级结构和三级结构进行了预测。关键词：硝酸盐高亲和力转运体，融合蛋白，小麦根，包涵体，谷胱甘肽．s．转移酶Ul首都师范大学硕士学位论文摘要AbstractInrecentyears，manyhighaffinitynitratetransportergeneWaSclonedfromplants．Forexample：BnNRT2fromB

4、rassicanapus、NRrZmpfromNicotianaplumbaginifolia、AtNRT2』andAtNRT22fromArabidopsisthalaiana、GmNRT2fromGlycinem“、BCHlandBCH2fromHordeumvalgare．andLeNrtl-JandLeNrtl-2fromLycopersiconesculenlumetc。ThefinalpurposeofourstudyWS,Stosublocalizetheproductofthehigllaffinityn

5、itratetransportergene·TaNRT2．1，whichWaSclonedbyourlaboratoryfromTriticumaestivum．AccordingtotheaminoacidsequencewhichWaSencodedbytheTaNRT2．t，wefoundafragmentwhichWaSconsidredhadthehighestantigenicity．AndthisfragmentWaSnamedbyAg．ThecorrespondingeDNAsequenceofthisf

6、ragmentWaSdesignedagainaccordingtothecodonswhichwaspreferredbytheEcoli。andWassynthesizedbytheSBSGenetechCo．，Ltd．Then，thisfragmentWaSclonedtothefusionproteinexpressionvectorpOEX_2T．Theearlystageofmyworkwentverywell：lclonedAgfragmentintothefusionproteinexpressionve

7、ctorpGEX·2T'thatwaspGEX-2T-Agforshort，andthenconstructedtherecombinantpiasmidsuccessfully．ThevectorpGEX-2Thasaglutathione—S-transferase(GST)gene，whichWasinfavorofthepurificationofthefusionproteinsubsequently．AndthereisathrombinsiteattheendoftheGST．whichwasinfavor

8、oftheseparationofthetargetproteinfromthemixturefusionproteininE．coil．Tll酷ehavebeenthefoundationoftheproductionofantibody,andWesternblottingtoo．Ihadinducedtheex