b型流感嗜血杆菌多糖制备工艺及其d蛋白原核可溶性表达研究

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1、硕士学位毕业论文学校代码：10023学号：$2010018021b型流感嗜血杆菌多糖制各工艺及其D蛋白原核可溶性表达研究HaemophilusinfluenzaetypebpolysaccharidepreparationandtheprokaryoticsolubleexpressionofitsproteinD所院：医学生物学研究所姓名：尹梦梦指导教师：廖国阳研究员导师小组：姜述德李映波孙明波李卫东学科专业：病原生物学研究方向：疫苗研究完成日期：2013年5月目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯．⋯⋯．．⋯．．．．．．．1Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2前言⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．⋯．4刖五⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．⋯．41．Hib概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．1Hib病原学及流行病学⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．2Hib多糖免疫机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．Hib结合疫苗⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．52．1结合方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52．2结合用载体蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52．3中国Hib疫苗应用现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．73本实验的目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7第一部分b型流感嗜血杆菌的多糖的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．1菌株来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．3主要仪器

4、设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．81．4主要试剂配方⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．1种子批制备及检定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．2Hib菌种的发酵培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．3多糖制备工艺⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l2．4连续三批fOOL发酵中试生产多糖的质量鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．133．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．193．1种子批检定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯193．2菌种扩大培养过程中各项鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．3多糖制备工艺的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．223．4连续三批IOOL发酵中试生产多糖的质量鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．244．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．285．小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28第二部分b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．1菌株及质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．2试

6、剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．3主要器材与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．4主要试剂配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．292．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．292．1HibCMCC58534株基因组的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．2b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．3重组表达载体的构建及克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3l2．4D蛋白的原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．5重组D蛋白

7、的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．352．6重组D蛋白Westernblot分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．353．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．1b型流感嗜血杆菌D蛋白(hpd)基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3．2重组表达质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3．3表达产物的SDS—PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．3．4D蛋白纯化过程中SDS—PAGE分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3．5重组D蛋白的Westernblot分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．4

8、．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4．1目的蛋白的分析与表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4．2表达系统与表达载体的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4．3重组D蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4．4重组D蛋白的纯化．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4．5本研究的意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5．小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯