a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究

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1、a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究流感嗜血杆菌包括可分型流感嗜血杆菌和不可分型流感嗜血杆菌，其中可分型流感嗜血杆菌根据荚膜多糖的结构又分为a～f6个血清型。接种b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)结合疫苗的所有国家，侵袭性Hib疾病的发病率降低了90%以上，而Hia的发病率明显升高。Hia与Hib疾病类似，死亡率高，后遗症严重。目前北美本土人群Hia发病率全球最高，1988～2003年，美国西南地区5岁以内儿童年平均发病率为20.2/10万。2003～2011

2、年，美国阿拉斯加共发生两次侵袭性Hia疾病暴发流行。借鉴Hib多糖蛋白质结合疫苗的成功经验，部分学者认为迫切需要制备Hia结合疫苗。　　结合疫苗的游离多糖含量是质量控制的重要指标之一，有研究显示，结合物的游离多糖含量与其免疫原性密切相关，游离多糖含量超过10%时，会降低结合物的免疫原性，因此，需要对结合物的游离多糖含量进行准确定量。　　载体蛋白质对结合疫苗结合化学的选择起重要作用，结合过程中可以选用载体蛋白质的羧基作为结合位点，也可选择氨基作为结合位点。对于TT，在甲醛脱毒的过程中会封闭一定量的氨基基团，反应不易控

3、制，从而导致不同批次TT的氨基含量差异较大。某些情况下可衍生载体蛋白质，包括ADH衍生，从而获得活性更强的肼基基团;也可用琥珀酸酐进行衍生，在氨基上连接琥珀酸基团以降低结合反应过程中蛋白质聚合。不同类型载体蛋白质的表面电荷分布有较大差异，导致制备的结合物在电荷分布上也存在较大差异，因此，应摸索一种适用于不同电荷分布的结合物的游离多糖含量测定方法。本实验拟建立脱氧胆酸钠(NaDC)盐酸法结合蒽酮硫酸法，以适用于检测破伤风类毒素(tetanustoxoid，TT)、TTADH衍生物(ADHderivativeofTT，

4、TTAH)、TT琥珀酰化衍生物(succinicanhydridederi-vativeofTT，TTSA)3种带有不同电荷的载体制备的Hia结合物的游离多糖含量。　　1材料与方法　　1.1样品Hia多糖降解物[荚膜多糖降解产物(depolymerizedpolysaccharide，de-PS)、批号：试De-201505003)]、Hia多糖衍生物[多糖降解物ADH衍生物(ADHderivativeofde-PS，de-PSAH)、批号：试HD-201506003)]、TT(批号：试HP-201209002)、

5、TTAH(批号：试HD-201504003)、TTSA(批号：试HD-2015-08003)均由本公司第一研究室制备，其中Hia生产用菌株HK643由丹麦奥胡斯大学Dr.Kilian教授惠赠。本实验使用的TTAH和TTSA均由TT(试HP-201209002)衍生制备。衍生物及结合物均由本公司第一研究室制备，多糖衍生物：多糖降解物经CDAP活化后，与ADH一端的肼基连接制备;结合物(2015-06001和201508006)：EDAC缩合多糖衍生物的肼基与TT或TTSA的羧基共价结合制备;结合物(2015-0600

6、2和201506003)：CDAP活化多糖降解物后直接与TT或TTAH共价结合制备。　　1.2主要试剂葡萄糖、蒽酮和NaDC均购自美国Sigma公司;盐酸、硫酸购自白银良友化学试剂有限公司。　　1.3蛋白质含量测定参照《中国药典》三部(2010版)Lou;l1%NaDC(pH7.3)加入1ml待检样品中，振荡混匀，于2~8℃静置30min;加入50μl1mol/LHC1，振荡混匀，4℃，20000g离心30min;取1ml上清，采用蒽酮硫酸法测定上清多糖含量。　　1.6Hia结合物游离多糖含量测定方法的建立　

7、　1.6.1NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量的影响将葡萄糖标准品配制成0、10、20、30、40、50μg/ml浓度，按1.4项方法进行检测，绘制标准曲线1，计算相关系数(r2)。将葡萄糖标准品配制成0、11.5、23、34.5、46、57.5μg/ml浓度，按1.5项方法进行检测，此时，葡萄糖标准品的最终浓度与标准曲线1一致，绘制曲线2，计算r2。　　1.6.2NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA最大能力的确定将TT溶液稀释至50、100、150、200、300、400、500、600和7

8、00μg/ml，TTAH溶液稀释至50、100、150、200、250、300、350、400和500μg/ml，TTSA溶液稀释至50、100、150、200、250、300、400、500、600和700μg/ml，按1.5项方法处理后，采用1.3项方法分别测定上清和总的蛋白质含量，按下式计算蛋白质沉淀效率。　　1.6.3最佳离子浓度的