小通草中多糖含量测定方法研究论文

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1、小通草中多糖含量测定方法研究论文张丽萍，李伟辉,江海霞，刘嘉铭，喻波【摘要】目的建立测定小通草中多糖含量的方法。方法以葡萄糖为标准，用高锰酸钾褪色光度法测定小通草中多糖含量。结果在一定条件下，葡萄糖还原高锰酸钾使其褪色，当葡萄糖含量在0～30μg/ml范围内时，其褪色程度与葡萄糖含量符合朗伯-比耳定律.freell）：称取0.2500g烘至恒重的葡萄糖于1000ml容量瓶中,水定容；高锰酸钾标准溶液（700μg/ml）；硫酸溶液（2mol/L）；上述试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。小通草（产地：四川）：购于重庆医药有限公司。1.2仪器AR1140电子分析天平（奥豪斯国际贸易

2、上海有限公司）；UV-2000紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］。2方法2.1原理及方法2.1.1原理葡萄糖还原高锰酸钾使其褪色，酸性(或中性)条件下Mn7+变被还原成Mn2+（或Mn4+），在一定条件下，其褪色程度与葡萄糖浓度的关系符合朗伯-比耳定律。2.1.2酸性条件测定方法在25ml比色管中，依次加入2.50ml高锰酸钾标准溶液，适量葡萄糖标准溶液，2.00ml硫酸溶液，水浴95℃加热15min,流水冷却，转移至25ml容量瓶中，水定容。另取1支25ml比色管，同上操作，仅不加葡萄糖标准溶液。用1cm比色皿，以水为参比，在波长525nm处，依次测得吸光度A，和

3、A0。其中，A0为褪色前高锰酸钾溶液的吸光度，A为褪色后高锰酸钾溶液的吸光度。计算求得ΔA=A0-A。2.1.3中性条件测定方法在25ml比色管中，依次加入2.50ml高锰酸钾标准溶液，适量葡萄糖标准溶液，水浴95℃加热35min,流水冷却，转移至25ml容量瓶中，水定容。另取1支25ml比色管，同上操作，仅不加葡萄糖标准溶液。干法过滤。用1cm比色皿，以水为参比，在波长525nm处，依次测得吸光度A，和A0。其中，A0为褪色前高锰酸钾溶液的吸光度，A为褪色后高锰酸钾溶液的吸光度。计算求得ΔA=A0-A。2.1.4样品处理方法［8］沸水提取小通草多糖（25g小通草，加500ml蒸

4、馏水，沸水、1.5h、提取3次），过滤、浓缩（至原体积的1/5）、醇沉（加3倍体积的无水乙醇），冰箱放置24h，析出粗多糖。Sevage法脱蛋白（多糖∶氯仿∶正丁醇=1∶0.2∶0.04），直至260nm和280nm处无明显光吸收为止，收集上清液。透析、醇沉、脱色（用0.2%活性炭脱色2次），干燥，得多糖粗品。溶解，加10ml2.0mol/L的硫酸溶液，沸水水解8h，取出冷却后加BaCO3中和，除去沉淀，收集上层清液，水定容至1000ml，得多糖水解物-混合单糖，备用。3结果3.1测定波FG长的选择扫描高锰酸钾吸收光谱（图1），选峰值波长525nm作测定波长。图1吸收曲线（略）3

5、.2高锰酸钾用量的选择按实验方法研究（仅改变高锰酸钾用量）。结果显示，当高锰酸钾用量大于3.0ml时，测定出的吸光度A0达到了1.5以上，仪器测定误差较大。本研究高锰酸钾用量选为2.50ml。3.3反应温度和反应时间的影响按实验方法研究。结果显示，随着温度的升高，ΔA逐渐增大，也就是褪色反应越来越完全。在酸性条件下，水浴温度为95℃时加热10min后，在中性条件下，水浴温度为95℃时加热30min后，ΔA不再增大且趋于稳定。本实验依次选水浴温度为95℃时加热15min、水浴温度为95℃时加热35min实验。3.4硫酸用量的选择按实验方法研究（仅改变硫酸用量）。结果显示，在酸性条件

6、下，硫酸用量为2.00～3.00ml时，ΔA最大，褪色效果好。所以，硫酸溶液用量选2.00ml。3.5葡萄糖为基准的可行性试验由于小通草多糖是由多种单糖组成的杂多糖，能否单纯用葡萄糖做标准计算多糖含量，需考察不同单糖与高锰酸钾的反应情况。研究时，为保证各类单糖参与反应的摩尔数和葡萄糖相同，将250μg/ml的葡萄糖换算成摩尔浓度为1.388×10-3mol/L,配制1.388×10-3mol/L的各类单糖。在1号比色管中，加2.00ml的葡萄糖，在2号比色管中，加2.00ml的阿拉伯糖，然后，按实验方法配制测定，平行3次。其余单糖同上测定。结果显示，以葡萄糖为基准，在酸性条件下，

7、半乳糖、甘露糖产生的误差小于5%，阿拉伯糖，木糖，鼠李糖等产生的误差均大于15%；中性条件下，甘露糖、阿拉伯糖，木糖，鼠李糖，核糖，半乳糖等产生的误差均小于5%。所以，本实验选中性条件测定小通草多糖。3.6干扰实验由于小通草多糖提取过程中，用到无水乙醇、氯仿、正丁醇，对此进行干扰研究。结果显示，在中性条件下，当测定的相对误差小于5％时，稀释一百倍后的上述物质均无干扰。3.7回归方程及相关指标的测定在中性条件配制测定葡萄糖标准系列的吸光度，绘制标准曲线（图2），其线性回归方程为：Δ