不同血清微环境培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及体外标记

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterBiologicalcharacteristicsofdifferentserummicroenvironmentsoncultureofratbonemarrowmesenchymalstemcellsandmarkinvitroByLiyangLiu一Supervisor：Prof．MingminDongotolaryngologyFirstAffiliatedHospitalofZheng

2、zhouUniversityApril2013原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：刘丽洋纠们奄日期：葛；零篇毒暑学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电

3、子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：刘丽洋珲日期：2汐01，3>军；穿心5R臼中文摘要不同血清微环境培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及体外标记硕士研究生：刘丽洋导师：董明敏郑州大学医学院郑州450052在骨髓基质中存在非造血细胞称为骨髓间充质干细胞或祖细胞。这种细胞在体内外

4、均能增殖和诱导分化成其他组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌健、平滑肌细胞、神经细胞和造血间质细胞等。这些细胞具有多向分化潜能、自我更新、高度增殖能力、易获得、自体损伤小、免疫原性弱、自体移植不发生排斥反应等特点，越来越受到医学研究者的青睐。目前在分子和细胞水平有大量的有效数据证明骨髓问充质干细胞可以应用于细胞替代治疗、组织器官移植和基因治疗等，是一种良好的替代治疗的靶细胞，具有广泛的临床应用前景。但是骨髓中骨髓间充质干细胞含量极少，只占整个骨髓中有核细胞的十万分之一，并随年龄增加而减少，．同时骨髓还含有其他多种细胞成分，因此

5、如何获取体外分离、纯化和扩增较高纯度和数量的骨髓间充质干细胞是目前亟待解决的问题。本文主要通过体外培养观察不同微环境下骨髓间充质干细胞的生长增值状态及纯度，寻找比较适合骨髓间充质干细胞体外生长的微环境，对其进行体外标记，为以后进行活体内移植标记追踪打下实验基础。目的观察四种不同血清微环境对大鼠骨髓问充质干细胞体外生长的影响。改良体外培养BMSCs的培养条件。用Hoechst33342标记法标记细胞观察骨髓间充质干细胞细胞，寻找合适的体外标记方法，为MSCs进行活体体内移植标记追踪打下基础。中文摘要方法选取6．8周龄SD雄性大鼠，从大鼠

6、股骨、胫骨中提取细胞，采用全骨髓贴壁法培养。体外分为四种培养方式：第一组(自身血清组)：原代细胞用含10％自身血清培养液培养，开始传代后换用含10％胎牛血清培养液培养；第二组(同种异体血清组)：原代细胞用含10％同种异体血清培养液培养，传代后用含10％胎牛血清培养液培养。第三组(胎牛血清组)：原代和传代后的细胞均采用含10％胎牛血清的培养液培养；第四组(无血清组)：原代细胞用基础培养液培养，传代后用含10％胎牛血清培养液培养。倒置显微镜下观察细胞形态，增殖情况，流式细胞仪检测细胞表面分子CD34和CD44的阳性表达率，Hoechst3

7、3342标记法标记观察细胞的标记率，及荧光持续时间及标记对细胞增殖的影响。幺士甲=日木1．显微镜下观察大鼠自身血清微环境下培养的细胞形态均一，呈长梭形，集落式或旋涡状生长，数量较多，第二组细胞形态与第一组相似，都具有高的纯合度和较短的首次传代时间。基础培养液培养下的细胞较稀少，只有稍许集落式生长。2．生长曲线图体现出自身血清组细胞倍增速度快于同种异体血清组和胎牛血清组，无血清组细胞生长缓慢无明显倍增速率。3．流式细胞仪检测细胞表面标志物’结果显示：前三组细胞CD44阳性表达率较高，均在95％以上，而无血清培养条件下CD44阳性表达率在

8、65．79％。这说明含血清的培养基培养的细胞纯度比不含血清组高4．大鼠MSCs经Hoechst33342标记后细胞核都在紫外光激发下显示亮蓝色，Hoechst33342的标记率几乎达到100％。标记上Hoechst333