缢蛏类胰岛素生长因子系统3个基因表达特征及功能初步分析

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1、学校代码：10264研究生学号：D150101001上海海洋大学博士学位论文缢蛏类胰岛素生长因子系统3个基因题目：表达特征及功能初步分析Expressioncharacteristicsandpreliminary英文题目：functionalanalysisofthreegenesintheinsulin-likegrowthfactorsystemofrazorclamSinonovaculaconstricta水产养殖专业：研究方向：水产动物种质资源与种苗工程姓名：谢淑媚指导教师：李家乐教授二O一八年六月上海海洋大学博士毕业

2、论文缢蛏类胰岛素生长因子系统3个基因表达特征及功能初步分析摘要缢蛏（Sinonovaculaconstricta）是我国重要的经济海产贝类，生长性状是其良种选育的重要目标。类胰岛素生长因子（IGF）系统是参与动物生长发育的重要系统，miRNA也广泛参与动物的生长发育调控。本论文结合生物信息学和分子生物学方法解析缢蛏IGF系统中3个基因结构及表达特征，体外验证基因间相互作用，筛选与缢蛏生长性状相关的SNP位点，对2个基因进行图谱定位，通过高通量测序的方法获得缢蛏发育时期miRNA数据库，挖掘参与调控IGF系统的miRNA，研究结果如

3、下。通过克隆获得缢蛏胰岛素多肽受体（ILPR）基因序列，发现该基因由可变剪切产生不含跨膜区和胞质区结构域的变异体（sILPR）。序列分析表明，ILPR编码1502个氨基酸，sILPR编码1157个氨基酸，这两个变异体cDNA序列氨基端相同，编码998个相同的氨基酸。通过半定量和荧光定量方法分析ILPR和sILPR的时空表达谱，表明sILPR在早期发育过程的表达量总体低于ILPR基因，在检测的成体组织中，ILPR基因在鳃组织中相对表达量最高，sILPR基因在斧足组织中表达量相对较高。通过原核表达，获得配体结合结构域的可溶性重组蛋白G

4、ST-LCL。GSTI上海海洋大学博士毕业论文pull-down结果表明该重组蛋白可与缢蛏的胰岛素多肽（ILP2）有特异性相互作用。通过直接测序法在缢蛏群体中检测到位于ILPR基因的10个SNP位点，其中4个位于非编码区，6个位于编码区，均为同义突变。通过与群体生长性状的关联分析发现，位于非编码区的4个SNP位点与缢蛏的壳长、壳宽、壳高和体重性状显著相关。连锁不平衡分析表明位于两个区域内的SNP完全连锁，两区域之间的SNP位点也高度连锁。通过其中一个SNP位点对ILPR基因进行图谱定位，结果表明，ILPR基因与缢蛏遗传连锁图谱11

5、号连锁群中26699标记连锁关系最强(LOD=33.01)，26699标记位于111.572cM的位置，这个位置的标记不属于缢蛏图谱的QTL区。通过基因克隆获得缢蛏IGF系统信号途径转录因子FOXO基因，这个基因在DNA结合区高度保守。荧光定量结果表明，FOXO基因在缢蛏成体进出水管组织中表达量最高，在缢蛏幼虫发育期间随发育进程而发生急剧变化。通过直接测序发现有5个SNP位点位于FOXO基因编码区，其中3个SNP位点为非同义突变。这5个SNP位点与缢蛏群体生长性状显著关联。用这5个SNP位点中的1个对FOXO基因进行图谱定位，表明

6、该基因与缢蛏高密度遗传连锁图谱中96616标记连锁性最强，位于图谱的9号连锁群37.020cM位置，这个位置的标记对缢蛏F1代个体的体重、壳高、壳长和壳宽关联值分别为1.31、1.04、1.53和1.32，不属于缢蛏的QTL区。II上海海洋大学博士毕业论文缢蛏IGF2BP基因共编码610个氨基酸，其编码的蛋白具有典型RNA结合结构域。原核表达获得可溶性的重组蛋白GST-IGF2BP，通过GSTpull-down和蛋白质谱方法初步筛选缢蛏肝胰腺和性腺组织中与IGF2BP有直接或间接互作的蛋白，结果表明IGF2BP主要与DNA和RNA

7、活动过程相关的蛋白有相互作用。通过高通量测序对缢蛏发育过程中8个时间点进行miRNA组学测序，分析结果表明在受精卵分裂期检测到已知的和新预测的miRNA分别为1145个和53个，囊胚期483个和66个，担轮幼虫期798个和69个；D型期742个和67个；壳顶期735个和59个；匍匐期624个和37个；单水管期772个和47个；稚贝期1110个和46个。对相邻发育时期的差异miRNA进行靶基因预测，进一步挖掘发现7个与缢蛏IGF系统信号途径相关的miRNA，这些miRNA通过共同调控与IGF系统功能相似或相拮抗的基因形成复杂的调控网

8、络。关键词：缢蛏，胰岛素多肽受体，FOXO，IGF2BP，GSTpull-down，单核苷酸多态性，图谱定位，miRNAIII上海海洋大学博士毕业论文Expressioncharacteristicsandpreliminaryfunctional