密码子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及其酶活性研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150250497上海海洋大学硕士学位论文密码子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表题目：达、纯化及其酶活性研究Prokaryoticexpression,purificationand英文题目：enzymeactivityofgoldfishTgf2transposasewithoptimalcodons专业：食品工程研究方向：生物化学姓名：赵茜指导教师：蒋霞云二0一八年四月I上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明

2、：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学

3、可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日II上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注吴文惠上海海洋大学教授主席陈丽花上海应用技术大学副教授委员陶妍上海海洋大学教授委员盛洁上海海洋大学讲师秘书答辩地点食品学院A209答辩日期2018.5.28III上海海洋大学硕士学位论文密码

4、子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及其酶活性研究摘要转座子(transposon)是一类可以在基因组中改变插入位置的遗传因子，能够通过水平转移(horizontaltransfer)的方式在自然界的不同物种间扩散传播。转座子所编码的活性转座酶能够启动其在生物体内的转座过程，然而脊椎动物中的一些转座子由于突变等原因大多数均已失去活性，成为了非自主性转座子，从而不能完成整个转座过程。2008年，在不同的金鱼品系中通过筛选，最终获得金鱼Tgf2转座子，它是继第一类具有自主转座活性的青鳉Tol2

5、之后的第二类具有自主转座活性的转座子，属于hAT(hobo-AC-Tam)超家族。Tgf2转座子能够编码完整、具有自主转座活性的转座酶，在鱼类转基因、基因捕获等方面具有广阔的应用前景。本实验室从金鱼胚胎中分离得到了7种不同的Tgf2转座子mRNA转录本，同时得到了三种氨基酸长度分别为686、650和577的Tgf2转座酶。目前这三种长度的转座酶均已在E.coli中表达，为了进一步提高表达量及其表达稳定性，依据大肠杆菌对密码子的偏好性和简并性对686长度的转座酶密码子进行了优化。本研究目的则是利用p

6、ET28a(+)作为质粒载体，E.coliBL21(DE3)作为宿主菌，表达出密码子优化后的686长度Tgf2转座酶，并研究能够保存纯化后的转座酶稳定性的方法。同时用含有不同重复序列数目的探针研究其DNA结合活性及特异性，从而为构建具有更高活性的转座酶提供帮助。本实验主要分为四个部分。第一部分为重组表达载体的构建，首先依据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对金鱼Tgf2转座酶的密码子进行优化，优化后83的Tgf2转座酶命名为Tgf2-TPase。用限制性内切酶BamI和XholI分别对含有83Tgf

7、2-TPase基因序列的克隆载体和表达载体pET28a(+)双酶切，用T4DNA连接酶将它们连接起来。根据转座酶和载体的特点设计合适的引物，PCR检测，用基因测序方法鉴定连接后的序列，序列对比结果表明，重组表达载体83pET28a(+)-Tgf2-TPase构建成功。83第二部分为重组载体pET28a(+)-Tgf2-TPase的原核表达、纯化和质谱鉴定。本实验中选择BL21(DE3)作为表达的宿主菌，使得重组载体质粒在BL21(DE3)IV上海海洋大学硕士学位论文中表达，表达条件为温度30℃、I

8、PTG浓度1.0mM、诱导时间6h、转速150rpm，用SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析。实验结果表明，在蛋白分子量大约为79.6kDa处不但有相应的条带出现，而且表达后此处的蛋白条带有明显加深，所以目的蛋白表达成功。在SDS-PAGE中可以表达出可溶性蛋白，故我TM们采用反复冻融、超声破碎、离心取上清的方法用HisTrapHP柱子对重组蛋白纯化，分别用20mM、40mM、500mM的咪唑对目的蛋白进行洗脱，将最终收集的纯化样品用SDS-PAGE分析，割胶并进行质谱