酶解猪血红蛋白制备降血压肽的工艺参数优化及体外降血压活性研究

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1、}0梦》，Category．T．．．．S．．．2．．．5．．．2．．．．．．9．．—3—SichuanAgriculturalUniversityDissertationforMasterDegreeResearchonOptimizingTechnologicalParameterofEnzymaticPreparationofAntihypertensivePeptidesDerivedfromSwineHemoglobinandHypertensiveActivitiesinVitroByGuoQiliangDirectedby

2、ProfessorLiChengYa’anSichuanJune，2010论文独创性声明洲⋯mm帅帅㈣㈣㈣wmY1800899本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：鄞考移≥#年‘月≥／日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保

3、留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名．辛考知别帷和／红／诈绷I1

4、＼‘彤年6月2f日M爹易乒≥1日M移匕j≥)：四川农业大学2007级硕士学位论文摘要猪血红蛋白经蛋白酶水解产生的具有降血压活性的多肽属于食源性生物活性肽，安全性高，研究报道其在降压功能方面具有较突出的表现，有望作为一种天然的降压组分获得广泛应用。本研究以血管

5、紧张素转化酶(AngiotensinI—ConvertingEnzyme，ACE)抑制率为指标，比较了不同蛋白酶水解猪血红蛋白得到的酶解产物的降血压活性(即ACE抑制活性)，并根据酶解产物的降血压活性筛选一种最适水解用酶。以猪血红蛋白为底物，选用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作为水解用酶，测定三种蛋白酶在各自适宜酶解条件下酶解猪血红蛋白产物的降血压活性及其水解度。研究结果表明，通过实验得到三种酶酶解6小时后，不同蛋白酶水解度由大Nd,依次为木瓜蛋白酶>胃蛋白酶>胰蛋白酶，而ACE抑制率为胃蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶。筛选出胰蛋白酶作

6、为水解用酶来制备具有较高降血压活性的猪血红蛋白酶解产物。以胰蛋白酶作为水解用酶，采用底物浓度、水解温度、pH值、酶用量及水解时间等单因素实验对猪血红蛋白进行酶解，评价每个因素下的最佳酶解水平范围，并通过设计正交时间对酶解工艺参数进行优化，以获得具有较高降血压活性的酶解产物。研究结果表明，胰蛋白酶最佳酶解条件为底物浓度10％，水解温度40。C，pH值9．0，水解时间6h以及酶用量2000U／g，此时产物ACE抑制率为62．54％。以胰蛋白酶作为水解用酶，采用优化得到最佳酶解条件对猪血红蛋白酶解，将制备的酶解产物进行超滤分离，以考察不同分

7、子量范围的酶解产物的降血压活性。研究结果表明各组分ACE抑制活性大小顺序为：Lc(分子量<5KDa)>Oe(酶解原液)>Me(10KDa>分子量>5KDa)>He(分子量大于10KDa)，ACE抑制活性最强的组分为分子量小于5KDa的组分。将分子量小于5KDa的组分配制为4、8、12、16、20、24、28pg／mL7种浓度的溶液，卡普托利配制为0．4、O．8、1．2、1．6、2．0、2．4．、2．8ng／mL7种浓度的溶液，并分别测定样品ACE抑制率。结果表明猪血红蛋白酶解产物分子量小于5KDa的组分的ACE抑制率活性Ic50为13

8、．69ug／mE，具有较强的体外降血压活性。对照样品Ic50为符合报道中卡普托利IC50值，说明本实验酶解产物ACE抑制活性研究具有可行性，并且说明本实验测定样品ACE抑制率的方法具有科学性。配制胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶3四川农业大学2007级硕士学位论文种模拟胃肠道消化的环境，对未经超滤和已经超滤处理的两个组分进行进一步消化处理，考察酶解产物在消化酶的处理前后的变化，以其ACE抑制率作为评价指标判断其胃肠道消化稳定性。结果表明：分子量小于5KDa的组分在处理前后的ACE抑制率变化不明显。而酶

9、解原液的猪血多肽在通过处理后，其ACE抑制活性都明显地降低。根据该结果评定出经胰蛋白酶酶解猪血红蛋白制备的降血压肽中分子量小于5KDa的组分具有高胃肠消化稳定性。本实验对猪血多肽作为降血压活性产品用于工业化生产奠定了实验