可溶性血管内皮生长因子受体1（sflt-1）对结肠癌细胞生长抑制作用实验的研究

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1、中山大学硕士学位论文可溶性血管内皮生长因子受体1(sFlt一1)对结肠癌细胞生长抑制作用的实验研究【背景及目的】专业：外科学学位申请人：吴荣耀导师：郑朝旭副教授摘要结肠癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居我国因肿瘤而致死亡原因的第四位，而且发病率有逐年上升的趋势。尽管当前的常规治疗手段，包括手术及放疗、化疗能在一定程度上缓解患者的痛苦，延长其寿命，但总的治疗效果还是不能让人满意。因此，迫切需要发展或联合新的治疗方法或新的治疗策略。以往的研究结果表明，肿瘤新生血管的形成不仅与结肠癌细胞的生长、增殖关系密切，而且与癌细胞的远处器官的转移也紧密相关，并可作为结

2、肠癌治疗的一个独立的预后因素。因此，针对肿瘤新生血管的形成己成为目前结肠癌治疗中的一个新靶点。肿瘤新生血管的形成受多种因素的影响，其中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是目前已知的最强的血管生成促进因子，它通过与其相应受体Fh。l(fms．1iketyrosinekinase—l，Fit．1)及Flk．1／KDR(fetalliverkinase．1，Flk-1／kinaseinsertdomain—containingreceptor,KDR)相结合是发挥其促血管生成的功能，其中Fit—l与V

3、EGF的亲和力比Flk一1高7—10倍。据报道，VEGF在正常肠上皮细胞中不表达或极低表达，与之相反，对结肠癌肿瘤标本的研究显示，VEGF在癌组织中高表达，结肠癌细胞可分泌大量的VEGF；进一步的研究显示，VEGF在癌组织中的表达水平与患者TMN分期以及预后密切相关。这些研究为下一步针对VEGF及其受体为靶点的治疗打下了良好的理论基础。中山大学硕士学位论文可溶性Fit．1(solubleFit-1，sFlt．1)是一种体内天然存在的、低表达丰度的VEGF拮抗剂，是内源性表达的Fit．1的剪切形式。sFlt．1缺少Fit．1的跨膜部分和胞内部分，与VEG

4、F结合后，不具备酪氨酸激酶的活性，可以抑制VEGF的促血管生成的生物学功能。已有研究证实，sFlt．1的第1．3个Ig样结构区域为与VEGF结合所必需，且等同于全长sFlt—l与VEGF的结合能力。应用sFlt—l对抗血管生成，是治疗肿瘤是理想的选择。基于以上所述，VEGF及其受体在结肠癌的发生、发展中起着重要的作用。针对VEGF及sFlt-1为靶点治疗结肠癌有着光明的前景。本研究针对sFlt一1这种天然存在的强大的VEGF拮抗剂，体外克隆构建sFlt—l的第1．3个Ig样结构区域，将其与真核载体pcDNA3．0连接后，转染结肠癌LoVo细胞，探讨其对

5、结肠癌LOVo细胞生长增殖的影响。【研究方法】1．应用RT-PCR的方法从人脐血静脉内皮细胞中扩增sFlt．1基因的第1—3个Ig样结构区域，并将其克隆至TA载体中。对TA克隆中的sFlt．1基因进行酶切及PCR鉴定，并测序。阳性克隆命名为T-sFlt。2．应用PCR的方法从T-sFlt质粒扩增sFlt．1基因，并将其与真核载体pcDNA3．0连接，构建真核重组质粒pcDNA．sFlt。应用酶切鉴定、PCR、DNA测序的方法，对重组体进行鉴定。3．通过脂质体Lipofectamine2000介导重组体pcDNA—sFlt转染结肠癌LoVo细胞。对转染后

6、筛选出的阳性细胞克隆，应用RT-PCT的方法检测sFlt．1mRNA的表达，应该ELISA的方法检测sFlt．1蛋白的表达。4．应用MTT法检测转染后的细胞上清对LoVo细胞生长情况的影响，同时用ELISA法检测不同转染时间段LoVo细胞上清中VEGF浓度的变化。【实验结果】1．以RT-PCR的方法从人脐血静脉内皮细胞中成功扩增出大小约1000bp的DNA片段；其与TA克隆载体连接后，经酶切及PCR鉴定，电泳结果表明有目的基因片段的插入；对T-sFlt重组质粒进行测序鉴定，测序结果同GenBank上的Fit—l的基因序列进行比对，完全吻合，未发现任何碱

7、基突变。II中山大学硕士学位论文2．以PCR的方法从T-sFlt重组质粒中成功扩增出大小约1000bp的DNA片段，与预计相符；PCR产物与真核载体pcDNA3．0连接后，经酶切及PCR鉴定，显示有目的基因片段的插入；对pcDNA．sFlt重组质粒进行测序鉴定，测序结果与GenBank上的Fit．1的基因序列进行比对，完全吻合，未发现碱基突变。3．pcDNA—sFlt重组质粒转染结肠癌Lov0细胞后RT-PCR检测目的基因mRNA表达，电泳可见目的基因条带，说明有转录水平上的表达。ELISA检测到细胞培养上清中sFlt．1重组蛋白，说明转染后的LoVo

8、细胞能表达sFlt一1并将其分泌到上清中，分泌量48小时达到高峰。4．各转染时段的细胞培养上清