用于异种移植的新型基因改造猪的构建

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1、分类号：Q812密级：单位代码：10312学号：20111077南京医科犬掌硕士学位论文南京医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：导师签名：力1素叩日期：如f牛年乡月彭日日期：加f车年石月乡日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交

2、论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)：1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密吵作者签名：南素们扣导师签名：日期：如f争年彳月衫日日期：．Ⅻ睁年石月／日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36附蜀毛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59攻读学位期间发表文章情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61致{身十⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62用于异种移植的新型基因改造猪的构建中文摘要目的：构建用于异种移植的新型基因改造猪，在原有的0【1，3．半乳糖基转移酶(Q．Gal)基因敲除以及腹膜蛋白(CD46)、血栓调节蛋白(TM)基因转入的猪胎儿成纤维细胞基础上，进一步将II类反式激活因子显性负向(CIITA．DN)基因转入猪的基因组，以抑制猪白细胞抗原SLA(瑚C)II类分子的表达，从而更加有效地克服多方面的免疫排斥反应。方法：设计合成博来霉素(Zeocin)抗性基因片段BGH．10xp．Zeo．Sv40pa．10xp，

5、插入pMD．108T载体，再利用限制性内切酶将其与含有CIITA．DN基因的pST205载体连接，构建置于人Tie2增强子和CMV13-actin启动子之下的CIITA-DN表达载体pNMUl05，将线性化的pNMUl05通过脂质体转染法转入已经敲除了0【．Gal并转入了CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B(DKO／CD46／TM)DK0／CD46／TM转基因的猪胎儿成纤维细胞(181B)，Zeocin抗性筛选转染pNMUIOS质粒的181B细胞，PCR方法检测CIITA．DN基因在181B细胞中的转入，获得阳性克隆并进行核移植，得到DK0／CD46／TM／CIIT

6、A．DN转基因猪。取仔猪的耳组织进行基因鉴定。结果：成功构建pNMUl05／CIITA．DN表达载体，转入181B(DKO／CD46／TM)细胞并经过Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆，顺利通过核移植得到DKO／CD46／TM／CIITA．DN转基因猪。仔猪组织经PCR鉴定，在592bp位置检测到预期条带，证明均为CIITA．DN转基因阳性。结论：通过数种异种移植免疫反应相关基因的改造，在抑制超急性排斥和补体反应、降低凝血和人CD4+T细胞免疫反应的理论基础上，得到了Q．Gal基因敲除以及CD46、TM与CIITA．DN基因转入的新型基因克隆猪。为异种器官移植中更加

7、有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活率做出了新的尝试。关键词：II类反式激活因子；显性抑制基因；猪白细胞抗原；异种移植；转基因猪2ProductionofanewgenerationofgeneticallymodifiedpigsforxenotransplantationAbstractObjective：Toproducenewgenerationofgeneticallymodifiedpigsasabetterdonorforxenotransplantation,CIITA-DNexpressionv