淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞的表达及与卵巢衰老的相关性研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞的表达及与卵巢衰老的相关性研究EXpressionofAmyloidPrecursorProteininoVariangranulosacellsanditsrelationshipwimoVariaIlaging课题来源：国家自然科学基金国家自然科学基金南方医院高层次匹配经费学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员论文评阅人牛静陈士岭教授妇产科学学术型硕士第一临床医学院罗深秋教授张清学教授孙筱放教授梁晓燕教

2、授李洁教授罗深秋教授张清学教授2014年月日广州硕士学位论文淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞的表达及与卵巢衰老的相关性研究硕士研究生：牛静指导教师：陈士岭摘要卵巢衰老尤其是早发型卵巢衰老(PrelnanlreOvarianAgillg，POA)伴随着卵巢产生卵子的能力减弱，卵母细胞质量下降是导致女性不孕的主要原因之一，极大威胁着女性的生殖健康。既往对卵巢衰老的研究主要集中于寻找出可以预测、评判卵巢功能的指标，然而关于卵巢功能下降的确切机制研究甚少。普遍认为年龄是影响卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老的发生存在着

3、极大的个体差异性，提示我们卵巢的内部因素比年龄更能决定生育储备功能。卵泡的生长发育异常、颗粒细胞的凋亡加速导致卵泡闭锁是卵巢储备功能下降的根本原因。研究参与调节卵泡生长发育、闭锁过程的基因对于揭示卵巢储备功能下降的机制有着重要意义。有关阿尔茨海默病(Al吐eimerDiseaSe，AD)的研究发现AD模型中的转基因小鼠均出现不育，在AD中发挥关键性作用的淀粉样前体蛋白(AmyloidPrecursorProtein，APP)及其代谢产物的水平升高。APP蛋白属I型膜整合糖蛋白，经p和丫分泌酶连续裂解的过程中

4、，APP被p分泌酶(p．siteAPPcleavingenzyme1，BACEl)水解产生一种APP羧基末端片段(C．teHninal触肿ent，CTF)⋯C99。C99包含一个完整的p样淀粉蛋白(Amyloidpp印tide，Ap)序列，随后在跨膜区内被Y分泌酶裂解生成具有神经毒性的Ap。BACEl几乎在人体所有的组织器官中均有表达，它是在APP的淀粉样分解途径中发挥关键作用的分泌酶，也是AB产生过程中的限速酶。Ap的产生、聚集和沉积被认为是AD发病机制的首要和中心环节。已证实转基因小鼠中APP的高表达及

5、其代谢产物摘要AD的增加使细胞更易受到氧化应激的损伤、降低细胞的抗凋亡能力并导致细胞死亡，提示APP及其代谢产物可能通过增加细胞对氧化应激的敏感性、诱导细胞凋亡的途径对卵巢内卵泡的生长发育和凋亡以及卵巢功能产生影响，而关于APP蛋白在卵巢衰老中作用的研究尚属空白。本研究拟采用分子生物学方法，从蛋白和基因水平探索APP蛋白、APP淀粉样裂解途径关键酶(BACEl)及凋亡调控基因Bcl．2家族成员在卵巢衰老患者的颗粒细胞中的表达情况，APP代谢产物AB42在卵泡液中的表达水平，分析其与卵子、胚胎数量和质量以及体

6、外受精．胚胎移植(InⅥ仃0FertilizationErnbryoTransfer，ⅣF．ET)临床结局的关系，探索APP及其代谢产物介导卵巢储备功能下降发生的可能分子机制，为预防和治疗卵巢衰老、卵巢储备功能下降提供理论依据。第一部分淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞中的表达及与IVF结局的相关性研究研究目的：检测行IVF／ICSI．ET治疗的不孕症患者的卵巢壁层颗粒细胞中APP的蛋白和基因表达水平，并分析其在不同年龄患者中的表达差异及与ⅣF结局的相关性，研究APP蛋白在卵巢颗粒细胞中的表达情况，并试图探索其与

7、卵巢衰老发生的关系。研究方法：1．收集自2012年12月．2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心行IVF／ICSI．ET治疗的不孕症患者的卵泡液，共192例。均为输卵管因素或男性因素不孕症患者。2．将收集的所有卵泡液采用PercoU密度梯度离心法分离提纯卵巢壁层颗粒细胞，用红细胞裂解液裂解其中存在的红细胞以减少实验干扰。3．选取67例样本进行蛋白质免疫印迹法(WestemBblot)检测APP蛋白的表达水平，按患者年龄将壁层颗粒细胞蛋白组分为：A组：<35岁，B组：》II硕士学位论文35岁&<40

8、岁，C组：》40岁；选取138例进行实时荧光定量聚合酶链反应(q眦titativereal．timepolymerasechainreaCtion，qIU’-PCR)检测APPrI瓜NA的表达水平，按患者年龄将壁层颗粒细胞基因组分为：A1组：<35岁，B1组：》35岁&“0岁，C1组：》40岁。4．收集所有标本的临床资料，采用SPSSl6．0统计软件分析比较各组中APP的表达水平及其与年龄、基础窦状卵泡数(An仃