没食子酸脱羧酶(gad)的分离及其酶学性质研究

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1、中国妹考舛学坼宪院学位论文万方数据学位论文作者指导教师姓名指导小组成员申请学位级别专业名称研究方向论文答辩日期李文君王成章王成章(研究员)沈兆邦(研究员)硕士林产化学加工工程天然资源化学与利用2015年6月◎中国·北京万方数据DissertationfortheDegreeCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：DateofDefence：LiWen-junWangCheng—zhangShenZhao-ban

2、gMasterChemicalProcessingEngineeringofForestProducts2015—6Degree·-conferring-·institution：ChineseAcademyofForestry万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均

3、已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：杏灵磊日期：矽脾6月订日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：杏泛嘉导师签名：王心0弹≯晦6月访日夕口旷年彳月玎日1学位论文作者毕业联系

4、方式工作单位：联系电话：13770646021电子邮件：!i鲨星西坠凸鱼!!@!鱼3：曼Q啦通讯地址、邮编：江苏省南京市玄武区锁金五村16号，210042万方数据摘要五倍子是中国特色林产品，常用作制备没食子酸(GallicAcid)和焦性没食子酸(Pyrogall01)的原料。焦性没食子酸广泛应用于农药、医药、化妆品、显影剂、热敏剂、高分子材料等领域。传统上，焦性没食子酸是通过没食子酸在强酸和强碱催化下化学脱羧制得，该方法不仅产生大量高色度的废水，严重污染环境，而且产品中催化剂残留难以去除，金属杂质偏高。因此，本课题考察微

5、生物转化没食子酸制备焦性没食子酸的新工艺研究，筛选出产没食子酸脱羧酶(GallicAcidDecarboxylase，GAD)的高产菌株，分离纯化GAD，并初步研究了GAD的结构及其酶学性质，结果表明利用微生物降解没食子酸制备焦性没食子酸具有广阔的发展前景。论文选择特定的培养基(即CDM培养基，由O．06％MgS04·7H20、O．4％mH4)2S04、0．2％没食子酸及30mmol·L’1pH为6．6的磷酸盐缓冲溶液组成)，以没食子酸作为唯一碳源进行底物诱导48h，通过发酵液中没食子酸降解率和焦性没食子酸产率的变化，从肠

6、杆菌属(EnterobacterSpp．，ESpp．)和柠檬酸杆菌属(CitrobacterSpp．，C．Spp)中筛选出产GAD的产气肠杆菌(EnterobacterAerogenes，EAerogenes)CICC23008，然后通过6个单因素的考察及响应面优化，确定优化工艺条件为接种量5％，底物浓度0．4％，磷酸盐缓冲溶液含量25％(pH为6．6)，发酵温度32。C，发酵液初始pH=6，底物质量分数0．32％，焦性没食子酸平均收率为77．86％。论文重点研究了GAD的分析方法、提取和分离工艺及结构表征。建立了考马斯亮

7、蓝法测定GAD蛋白含量线性方程(Y=4．8485X+0．4865，R2=0．9943)和双缩脲法测GAD蛋白含量线性方程(Y--0．2476X+0．0003，R2=0．9993)。对EAerogenes在优化条件下产生的GAD粗酶液，分别采用pH为6浓度为60％和70％的硫酸铵盐沉淀32h时效果最好；然后，采用80kD透析膜进行透析纯化，若500mL料液则膜处理时间12～16h，透析效果较好；再将透析液经二乙氨基乙基(DiethylAminoethanol，DEAE)纤维素树脂分离纯化GAD蛋白，DEAE在pH为6．5时对

8、GAD的静态吸附的饱和吸附量可达2．838mg·g．1．在pH=7．5时采用0．4mol·L。NaCl溶液进行洗脱，洗脱液再利用G．75和G．100葡聚糖凝胶纯化GAD蛋白样品，蛋白质含量为59．3％，最大吸收波长为225nlTl。采用SDS—PAGE聚丙烯酰胺电泳分离得到蛋白样品条带beltl，采用M