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1、第39卷第1期东北农业大学学报39(1):134~1382008年1月JournalofNortheastAgriculturalUniversityJan.2008文章编号1005-9369(2008)01-0134-05反向遗传操作研究进展1,2222*吴波平,时洪艳,陈建飞,冯力(1.东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)摘要:反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段。文章综述了反向遗传操作的研究策略,包括全长克
2、隆的获得、体外转录和病毒的挽救,概括了反向遗传操作在病毒分子生物学研究、疫苗的研制、基因治疗和重组载体中的应用,分析了当前反向遗传操作研究中存在的问题。关键词:反向遗传操作;感染性克隆;全长克隆;体外转录;病毒挽救中图分类号:Q785文献标识码:ARNA病毒的反向遗传操作,即构建RNA病毒1.1全长cDNA的构建的DNA副本,并在DNA水平对病毒基因组进行微基因组由于只含有一个小的报告基因,因而定向修饰,模拟真实病毒粒子的生命周期,研究便于进行分子生物学操作,为探索和优化病毒拯救病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用。条件提供了有力手段。因此在研究病毒拯救之前,RNA病毒突变率较高,直接
3、对其进行定向操作比一般构建微基因组衡量病毒拯救的效率,其中最早[2]较困难。基于DNA水平的反向遗传操作为研究的微基因组挽救模型是水泡性口膜炎病毒(VSV)。RNA病毒的复制及调控机理、病毒毒力、病毒-构建全长cDNA的方法主要有长距离PCR、融宿主相互作用和研制新型疫苗等提供了重要手段。合PCR、体外cDNA连接和全长克隆拼接。长距离[1]自1978年第一例反向遗传操作获得成功后,一PCR的缺点是Taq酶固有的错配率,造成PCR扩系列RNA病毒的反向遗传操作研究捷报频传。本增过程中不可避免的基因突变。融合PCR的缺点文概述了反向遗传操作的策略、应用及目前存在在于多次PCR造成的突变很大,
4、现在多不采用此的问题。法构建全长克隆。体外cDNA连接虽然能最大限度地减少PCR扩增过程中的错配,但多次拼接对1反向遗传操作策略[5]DNA的损伤和损失也应该引起注意。现在广泛使病毒的反向遗传操作系统的构建主要分为以用全长克隆拼接的方法构建全长cDNA。下两步,首先通过体外扩增、分子克隆等获得全目前反向遗传操作使用的启动子主要有T3、长病毒基因组的克隆,或微基因组克隆,然后将T7、SP6、聚合酶Ⅰ启动子、聚合酶Ⅱ启动子和巨体外转录本转染细胞或全长cDNA直接转染敏感细细胞病毒(CMV)启动子,这些启动子加到基因组胞,在细胞中完成病毒基因组的复制、装配,成5′端的方式主要有:①将病毒基因组插
5、入到载体启[3]功挽救出病毒。在构建病毒基因组全长克隆的过动子下游,使用载体启动子。这种方法将引入较程中,涉及到一系列影响病毒复制、毒力以及全多5′和3′端非病毒基因组序列。②将启动子序列长克隆稳定性的因素,下面分别详述。直接引入引物中,通过体外转录本转染细胞挽救病[4]毒。③启动子序列加到引物中,通过转染到稳定收稿日期:2006-08-29表达相应聚合酶的细胞系中提取转录本,或者直接作者简介:吴波平(1982-),男,江西人,硕士研究生,研究[5]挽救病毒。④全长克隆通过和表达聚合酶的辅助方向为动物病原学。*通讯作者E-mail:fengli_h@163.com质粒如重组痘病毒共同转染[
6、6],同时为减小痘病毒第1期吴波平等:反向遗传操作研究进展·135·的细胞毒作用,现已使用复制缺陷型痘病毒(如的病毒转录本与宿主细胞的mRNA相似,不经过[7]MVA-T7),并用阿糖胞苷、利福平或紫外交联抑复制就可表达野生型或突变型蛋白。最早体内转录[8][3]制重组痘病毒的复制。获得感染性克隆的病毒是脊髓灰质炎病毒,后来普遍认为,全长cDNA克隆的稳定性严重制约人们发现科萨奇病毒和肝炎病毒A的cDNA也都[15-16]病毒挽救的效率。病毒基因组插入载体转化大肠杆具有感染性。随着反向遗传操作的逐渐成熟,菌后易出现突变、重排、缺失、插入和替换,影响人们越来越倾向于通过体内转录构建感染性克隆
7、,[17]到病毒的复制和转录,原因之一可能是病毒蛋白对避免体外转录操作过程中的种种麻烦。宿主菌有毒性,使有重组载体的菌死亡或者宿主菌1.2.2体外转录挽救病毒为存活需要对重组载体进行“改造”,从而导致了全现在较多采用的仍然是重组质粒体外转录,以长基因克隆的不稳定。目前,克服基因组全长克隆转录本转染真核细胞挽救病毒的策略。该策略的的不稳定性主要有以下几种途径:①分段构建覆优点是不仅能避免DNA转染引起的RNA拼接和盖全长基
