反向遗传操作技术在禽流感研究中的应用

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1、反向遗传操作技术在禽流感研究中的应用安徽农业科学,JournalofAnhuiA.Sci.2006,34(1O):2069—2071责任编辑曹淑华责任校对曹淑华反向遗传操作技术在禽流感研究中的应用崭庆功l,崔丰色红2(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳ll0l6l;2.河南科技学院动物科学学院,河南新乡4530o3)摘要反向遗传操作技术的建立为负链RNA病毒的研究开创了新的途径,使负链RNA病毒的许多特性得以深入认识,目前此技术已广泛应用于多种负链RNA病毒的研究中.禽流感近几年在全球的广泛爆发,使得对流感病毒的深入研究更加迫切,反向遗传操作技术的应用,使禽流感

2、病毒的基因结构,致病机理,与宿主细胞的相互关系等各方面的研究工作都取得了巨大进步.笔者就国内近几年取得的进展做一综述.关键词反向遗传技术;禽流感:应用中图分类号Q311+.8文献标识码A文章编号0517—6611(2006)10—2069—031流感病毒反向遗传技术发展概况反向遗传操作技术(reversegenetics)是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作,如进行基因点突变,缺失,插入,颠换,转位和互补等改造,以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理,RNA编辑和自发重组与诱导重组,病毒与宿主间的相互作用关系,抗

3、病毒策略,基因治疗研究,以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等川.它解决了对RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题.从cDNA克隆拯救出负链RNA全病毒是20世纪90年代分子病毒学研究领域最振奋人心的突破之一,它开启了人们对病毒基因组进行人工操作和详细了解病毒基因及其产物功能的大门,该技术的迅速发展,引起了国内外研究者的极大关注【一.流感病毒为分节段,单股负链RNA病毒,对其分子生物学方面深入的研究,是在1989年由Luyqes等人创立了流感病毒反基因操作技术之后才得以实现的.在此之前对流感进行的研究,重点是对流感病毒RNP中各种蛋白成分的分

4、离及其在体外重建,如用SDS.PAGE方法分离NP和病毒RNA聚合酶亚单位P蛋白(PA,PB1,PB2).Parvin(1989)等人报道了用氯化铯甘油梯度离心法从vRNP中分离有活性的RNA聚合酶复合体,用体外合成的流感病毒基因组两端保守序列和报告基因重组的外源RNA分子与NP蛋白形成RNP复合体,能检测到RNA的复制和转录.流感病毒反基因操作技术的突破性进展完成于1999年.Neumann等圆满地完成了对流感病毒的反基因操作工作,他们完全用质粒DNA转染细胞,利用细胞中的转录和翻译机制,得到了具有感染性的,完整的流感病毒.在Luy~es等人首次对流感病毒进行基因

5、组操作近10年之后,病毒学家最终获得了对流感病毒进行复杂而深入研究的有利工具,可以研究流感病毒蛋白和RNA因子在病毒复制和致病性方面的各种特性.2000年,在流感病毒反基因操作技术方面又取得了重大的进展.ErichHoffmann等人将Neumann等人和ErvinF0dor等人于1999年完成的,需12～17个质粒共转染细胞获得活病毒的反基因操作技术减少到仅需8个质粒进行共转染.在这一系统中,病毒cDNA被插入在DolI启动子和终止子序列之间,而完整的DolI转录单元的两侧分别是作者简介韩庆功(1976一),男,河南汝州人,硕士研究生,研究方向:动物传染病防治.收

6、稿日期2006.02.28polⅡ启动子和polyA序列.这2套转录单位就使得从一个病毒cDNA模板上可以同时合成负链病毒RNA和正链mRNA,并以此为基础,利用宿主细胞的复制,转录机制,产生并释放出具有感染性的流感病毒颗粒.2在低致病性H9N2亚型的研究应用2.1病毒粒子的拯救石火英等应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV.将MChicken/Shanghai/F/98(CK/SH/F/98)株H

7、9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polI转_polII录/表达载体DHW2000中,构建成8个转录/表达载体重组质粒.将这8个质粒共转染COS_l细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,48h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒.经血凝,血凝抑制试验,序列分析证明确为拯救株.成功拯救RF株为研究H9N2亚型AIV传播的分子致病机制及构建新的流感疫苗株打下了坚实的基础嘲.2.2传播途径的分子机制石火英等利用反向遗传技术,通过基因重排方法,产生2个表面基因来自MChicken/Guangdong/SS/94(H9N2)禽流感病毒(