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1、生物秀实验频道——努力做您的实验助手！http://www.bbioo.com/bio101/反反向向遗遗传传操操作作技技术术生生物物秀秀搜搜集集整整理理wwwwww.bbbbiioooo.ccoom反向遗传操作技术( reversegenetics)与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反，是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒cDNA 分子水平上对其进行体外人工操作，也被称为“病毒拯救(therescue of virus)”。反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列
2、的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA 拷贝,使得cDNA 本身或从cDNA 体外转录所得的RNA 具有感染性。RNA 病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因
3、组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒宿主相互作用。自1978年第一例RNA 病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA 病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。该技术的核心是首先构建RNA 病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA 聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RAN转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA 分子,因此可以在DNA 水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的
4、效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新型的疫苗。目前已有许多RNA病毒的全长感染性cDNA克隆构建成功。俺就是搞流感病毒的反向遗传的，而且，现在搞得非常的溜，拯救的成功率是90%以上。先贴上我的论文中对此领域的背景介绍：Theearliestreversegenetics techniquesfornegativestrandedRNA viruses weredevelopedonly forinfluenza A virusin deed(Enami et al.,1990; Luytjes et al.,1989)
5、.But for alongtime,thefundamental research ofthisvirushasbeen hamperedby the lack oftheefficientreversegenetics systems.Therescue of中国生物科学论坛【生物秀论坛】1 http://www.bbioo.com/bbs/生物秀实验频道——努力做您的实验助手！http://www.bbioo.com/bio101/influenza virusentirelyfromcDNA wasfinished in1999(Fordoret al.,1999; Neuman
6、netal.,1999).Such plasmiddriven synthesisof viral RNA andprotein allows therecoveryof infectiousinfluenza viruswithouttheneedofhelpervirusinfection.In these reports Influenza virus wasregeneratedby transfection of eukaryotic cells (293cell orcos1cell)with a setof12or17plasmidsencodingandexpressin
7、gtheviral nucleotide andproteins.Theefficienciesof virusproduction of 12plasmidsystemswere relativelylowerthanthe17plasmidsystems,with which only has 104plaqueformingunits(PFU)of influenzavirusA/WSN/33per mloftransfect
