流感病毒的反向遗传学研究进展

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2、为反向遗传学技术。在病毒学研究中，反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒，从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响。最早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统。将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞，可使RNA充任mRNA(s)从而可翻译出病毒蛋白；反过来，这些蛋白又有助于完整病毒的包装。　　　　与正链RNA病毒不同，负链RNA病毒的基因组无信使功能并且无感染性。从病毒RNA开始转录需要病毒的核糖核蛋白复合体（RNP)的存在。RNP对病毒RNA转录为mRNA和病毒基因组的复制是必须的。利用反向遗传学，从cDNA获得的第一个完整负链R

3、NA病毒是狂犬病毒。另有一些研究者对Semia、Ebola病毒进行了反向遗传学研究，但拯救效率较之正链RNA病毒低得很多。　　　　分节段的负链RNA病毒的反向遗传学操作尤显困难。通过努力，分节段的负链RNA病毒的反向遗传学最终在布尼亚病毒上获得突破，并随后在流感病毒等取得了一系列进展。此文就流感病毒的反向遗传学的发展历史及其应用作一综述。　　　　1.流感病毒的反向遗传学发展概述　　　　流感病毒属正粘病毒科成员。同多数负链RNA病毒不同，流感病毒在感染细胞的核内完成复制。在受体介导的吞饮和膜融合之后，病毒的核糖核蛋白复合体（vRNP)释放入细胞浆。vRNP包括病

4、毒RNA、核蛋白（NP)和3个多聚酶蛋白（PB1、PB2和PA)被运送至细胞核，在此完成转录和复制。负链的病毒RNA不能作为蛋白质合成的直接模板。相反，NP包裹的vRNA必须经病毒多聚酶转录为mRNA在复制中，病毒RNA作为全长互补RNA(cRNA)的合成模板；合成的cRNA又可作为子代病毒RNA的合成模板。所以流感病毒复制的最小功能单位是vRNP复合物。故A型流感病毒的产生需要8个功能性的RNP复合物，并且这8个复合物必须进入细胞核。　　　　在实验室水平体外产生病毒始于20世纪80年代。其时已从感染的细胞和变性剂处理的病毒中获得具有复制功能的vRNP，其后有

5、学者又证实了vRNP的体外活性。1989年，Parvin等和其同事获得了从克隆化cDNA获得的vRNA的病毒，从而首次建立了对负链RNA病毒进行体外修饰的系统，揭开了重配病毒研究的新篇章。Enami等14将体外转录后的vRNA、纯化的NP和多聚酶蛋白装配成RNP复合物。但是这个系统所产生的子代病毒多是辅助病毒，所以需要从抗体介导的生长限制作用、温度敏感性、宿主样，存在病毒产毒量特别低的缺点。　　　　随着狂犬病毒的感染性cDNA克隆的诞生和一个分节段的负链RNA病毒一布尼亚病毒的反向遗传学的成功，从克隆的cDNA产生流感病毒的技术难关终于在1999年得到突破。N

6、eumann研究小组161构建了含A/WSN/33CH1N1)全部8个基因片段的克隆，所有基因片段均置于人RNA多聚酶I启动子和鼠RNA多聚酶终止子序列之间，另外9个真核表达质粒负责病毒蛋白的合成，此即17质粒系统，在转染细胞上清中，产毒量达1X107/mU随后，该小组对17质粒系统进行了改进，将负责蛋白合成的真核表达质粒改为4个，分别负责PA、PB1、PB2和NP的合成，以供病毒RNA的转录和复制之用。该系统称为12质粒系统，转染上清中能产生高达1X108/mL的病毒粒子。其转染效率很高的原因。　　　　Hoffmann等17

7、对RNA聚合酶I系统进行了改进。

8、编码病毒基因片段的cDNA以负链方向克隆于RNA聚合酶I启动子和终止子序列之间；构建好的表达盒又正向插于RNA聚合酶II启动子和牛生长激素poty(A)信号之间。这样，RNA聚合酶I负责转录产生负链病毒RNA，而RNA聚合酶II负责正链mRNA的合成，从同一模板便可同时产生vRNA和mRNA，无需另外的质粒来负责蛋白质合成。这个系统称为8质粒系统，有助于不能高效转染的细胞系产生重配病毒。另外，这个系统避免了在一个或多个基因片段产生致死性突变的病毒样颗粒的产生。8质粒拯救系统相对于17/12质粒系统，减少了表达各病毒蛋白的质粒，使拯救时需要转染细胞的质粒数大大减

9、少，因此提高了病毒拯救效率。相当于RN