B型流感病毒反向遗传平台的构建及其应用.pdf

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1、单位代码：８４５０１学号：Ｓ８４５０１１３０１８．，＇＇１；｜萨硕女《像讼ＡＩ吉＊ｆｉ四Ｂ型流感病毒反向遗传平台的？爱病构建及具应用！＾究生ｔ：张瑶作Ｉ制／ｃｑ培养单位：中国疾控中心病毒病所流感室！ｊ导师，：王大燕研究员Ｉ心＃副导师：周剑芳研究员秦垫助理研究员专，业：病原生物学２０１６年学校代码：８４５０１学号：Ｓ８４５０１１３０１８硕女《後化头Ｂ型流感病毒反向遗传平台的构建及其应用研究生：张瑶培养单位：中国疾控中也病

2、毒病所／流感室导师：王大燕研究员副导师；周剑芳研究员秦壁助理研究员专业；病原生物学中国疾病巧防捨制中也２０１６年学位论义原创性、真实性声明本人郑重声明：《Ｂ型流感病毒反向遗传平台的构建及其构＇建》是本人在中国疾病预防控制中‘心病原生物学专业攻读硕壬学位期间。我承诺：本论文，在导师指导下完成的硕壬学位论文■中所涉及的所有数据、试验记录＾乂及研究結果均真实可信，引用出处、。如本论文资料已注明，无剩窃、篡改抄袭之行为原创性方面出现问题。，我愿负法律责任‘。所有本课题的研究成果归中国

3、疾病预防控制中，发表文章＇？心的单位署名为中国疾病预防控制中。特此声明！学位论文作者（签違）：杂金研究生导师（签違）：２０１年月日２０１年月日目录中文巧要１Ａｂｓｔｒａｃ２ｔ前胃４一Ｂ型流感病７第部分构建奉反向巧传技术平台７１材料与耗材７１．１细胞７１２．鸡Ｅ７１．３病胃４７１．主要试剂与配制方法８１．５主要耗材１９乂主要仪器２方法１０２１１０．病毒核酸提取１０２．２目的片段扩増实验２１２３．琼脂糖凝胶电泳２４１２

4、．产物回收实验１４２５ＢｓｍＢＩ．限制性内切酶酶切体系１４２乂载体连接实验２１５．７细菌转化实验２８１７．质粒提取１８２．９转染实验２２３结果３．１目的片段获得及基因序列分析２２２３３．２质粒构建２４３３．捶救病毒及重配病毒鉴定Ａｉｍ２４第二部分利用反向遗传平台构建重祀病毒并对重配病奉进行生长特性研究巧２７１材料与耗材１１．细胞７２１．２鸡ｆｉ７２１３．病胃２７１．４主要试剂与配制方法２７１．５主要耗材２８１乂主要仪器２８

5、２方＆２８２．１细胞复苏与传代２８２．２病毒细胞传代２８２．３病毒鸡胚传代方法２８２．４神经氨酸酶活性检测实验２９２．５半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤｓｏ）实验３１２．６病毒生长曲线实验３３２．７逐救重配病毒３４３结ｍ３４３．１病毒进化分析３４３２．病毒生长曲线测定３５３．３神经氨酸酶活性检测结果３８３．４系间重配病毒的片段替换３９４職４３第兰部分猶４６参考文献４７综述４９胃谢５５附录Ｂ发表文章全文５７中国疾病预防控制

6、中也硕±论文Ｂ型流感病毒反向遗传平台的构建及其应用中文搞要研究目的：构建Ｂ型流感病毒反向遗传技术平台，并利用该反向遗传系统构建Ｂ型流感重配病毒，研究影响病毒生长特性的因素。研究方法：利用Ａ型流感病毒反向遗传系统ＰＨＷ２０００载体为骨架，构建Ｂ型流感病毒反向遗传平台，即构建包含病毒各节段的８个重组质粒，将重组质粒混合后共转染２９３Ｔ及ＭＤＣＫ混合细胞，培养后Ｗ鸡胚或细胞传代姪救Ｂ型流感病毒重配病毒；根据病毒基因组序列特点－１，挑选２０１３２０５年间我国分离的Ｂ型野生型及系间重配流感病毒作为研

7、究对象，利用半数组织培养感染剂量（Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ，简称ＴＣＩＤｓｏ）方法计算病毒液含有的颖粒数，稀释病毒液至颗粒数相同后再感染ＭＤＣＫ细胞，收集各时间点的病毒培养液，进行病毒滴定，Ｗ培养时间点为横坐标，各时间点下病毒滴度为纵坐标，获得病毒生长曲线：检测病毒神经氨酸酶活性，并酶活动力学常数Ｋｍ值表示；尝试利用构建的Ｂ型流感反向遗传系统，逐救不同组合的重配Ｂ型流感病毒，测定重配病毒的生长特性，分析影响病毒生长特性的因素。主要结果：２０－成功构建了Ｂ型流感病毒反向遗传技

8、术平台并加Ｗ应用；发现１３２０１５年我国０－４化病毒滴度分离的野生型病毒及系间重配病毒的生长曲线走势相似，在感染后的７２ｈＫｍ１－４０不断上升，可维持至后病毒滴度逐渐下降，病毒的值分布于６之间；利