嗜酸乳杆菌共轭亚油酸异构酶基因的表达研究

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1、河南工业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌共轭亚油酸异构酶基因的表达研究姓名：董理申请学位级别：硕士专业：农产品加工及贮藏工程指导教师：曹健20070501摘要共轭亚油酸(Conjugatedlinoleicacid'CLA)是一类在9．与11．位、10．与12．位或11．与13一位碳原子处有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸。在共轭亚油酸的各种异构体中，只有c9，t11-18：2和t10，c12·18：2两种异构体具有多种生理活性，如抗癌、抗粥状动脉硬化、抗氧化、降低胆固醇、减肥、促进生长等，因而在食品、保健品、医药、化妆品等领域有着广阔的应用前景。一些微生物可以产生共轭亚

2、油酸异构酶(Conjugatedlinoleicacidisomerase)，该酶能专一性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体的反应，因此近几年来倍受关注，利用生物法制备共轭亚油酸已成为今后共轭亚油酸工业合成的发展趋势。本文首先利用Blast(NCBI)、Bioediter等生物学软件，根据已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组序列和罗伊氏乳杆菌共轭亚油酸异构酶的核苷酸序列，预测了嗜酸乳杆菌中共轭亚油酸异构酶的序列。之后根据所预测的嗜酸乳杆菌共轭亚油酸异构酶基因序列以及载体pET30a(+)的物理图谱设计了一对引物，对嗜酸乳杆菌ASl．1854基因组进行PCR扩增，得到

3、一条1776bp的目的条带，并构建了pET30a(+)／共轭亚油酸异构酶重组质粒，将重组质粒导入表达载体大肠杆菌BL21∞E3)pLYS中。通过对表达条件进行优化，采取诱导温度16"(2，诱导剂IPTG浓度O．1mmolfL，对含有重组质粒的BL21(DE3)pLYS进行诱导表达，首次表达出了可溶性的嗜酸乳杆菌重组共轭亚油酸异构酶。最后，采用了Ni2+金属鳌合层析对重组蛋白进行了分离和纯化，以200mmol／L的咪唑洗脱液进行洗脱，获得了可溶性的目标蛋白。但是气相色谱分析表明，重组蛋白没有共轭亚油酸异构酶活性。关键词共轭亚油酸异构酶；共轭亚油酸；嗜酸乳杆菌ASl．1

4、854；基因克隆表达纯化AbstractConjugatedlinoleicacid(CLA)isagroupofoctadecadienoicfattyacidsthatcontaincis-／tram-conjugateddoublebondsinthepositionof9and11、10and12、11and13ofthechain．AmongalloftheCLAisomers，c9，tll·18：2andt10，c12-18：2isomerswereconsideredtobethetwowithmanyimportantphysiologicalact

5、ivities，suchasanticarcinogenicactivity,antiatherogenicactivity,antioxidation．aswell豳theabilitytoreducecholesterol，reducebody-weightandenhancegrowthpromotion，andthusshowedawidefieldofapplicationinf00d，healthcare，medicineandcosmeticindustry．Somemicroorganismscouldproduceconjugatedlinolei

6、cacidisomerase，whichcouldcatalyzethechemicalreactionoflinoleicacid(LA)toeitherorbothofthetwoCLAisomerswiththeabovephysiologicalactivities．Therefore，theproductionofconjugatedlinoleicacidthroughbiologicalmethodwasconsideredtobethedevelopinga-endofindustrializationinthefuture，SOconjugated

7、linoleicacidisomerasehasbeenattractingtheattentionofmanyresearchersinandabroad．AccordingtothepublishedgenomesequenceofLactobacillusacidophilusNCFMandnucleosidetriphosphatesequenceofconjugatedlinoleicacidisomerasegeneofLactobacillusrerteri,theconjugatedlinoleicacidisomerasegeneofL．aci