米曲霉产氨基酰化酶最佳活力条件的研究

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1、发酵科技通讯39米曲霉产氨基酰化酶最佳活力条件的研究刘毅袁月华(湖南机电职业技术学院生物化工系湖南长沙410151)摘要：通过在不同的反应时间，反应温度，缓冲液种类及pH条件下测定氨基酰化酶的活力，得出氨基酰化酶的最佳活力条件。试验结果表明，氨基酰化酶在反应温度为37℃、磷酸缓冲液pH为7．5、与底物反应30min时，活力最高。关键词：米曲霉氨基酰化酶最佳活力条件氨基酰化酶(AminoacylaseEC3．5．14)是生物院微生物学实验室提供。体内进行氨基酸代谢的一种重要的水解酶⋯。它1．1．2培养基能立体选择性地将N

2、一酰基一L一氨基酸水解，适合1．1．2．1供试菌斜面，茄子瓶培养基：马铃薯培养于多数外消旋氨基酸的拆分，得到L一氨基酸和基[31；土豆200g，蔗糖或葡萄糖20g，琼脂20g；pHN一酰基一D一氨基酸的混合反应液，然后利用二者值自然，此培养基用于菌种保藏和斜面种子培养。溶解度差结晶分离，可以得到L一氨基酸[21。酶法制1．1．2．2筛选培养基：250ml三角瓶装4．5g麸皮、备L一氨基酸是在有机合成与发酵法基础上发展5．5g豆饼粉、llml水，pH自然，121℃灭菌15min。起来的一个新工艺。氨基酰化酶最早是从动物的

3、1．1．3原料和试剂：N一7，酰一DL一丙氨酸(购自东肝脏和肾脏中发现的，并且也从中提取到了酰化京化成工业株式会社)，麸皮，豆饼粉，玉米粉，可酶，但其酶的来源受到很大限制，所以人们开始尝溶性淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，糊精，麦片，红薯试用微生物发酵提取酰化酶。经过对细菌、曲霉等粉，蛋白胨，酵母膏，油菜籽，尿素，硫酸铵，硝酸菌试验，发现从曲霉菌发酵液中提取到的酰化酶，铵，硝酸钾，0．45％生理盐水，pH=7．0的磷酸缓冲活力较高，并且通过在培养基中加入蛋白水解物，液，l％抗坏血酸(当天配)，茚三酮溶液，4mol／L醋可将胞

4、内酰化酶诱导到胞外，得到胞外酰化酶。因酸缓冲液(pH4．5)，氨基酸标准液，Tris缓冲液。此，现在的氨基酰化酶都是由曲霉发酵得到的胞1．1．4仪器及有关设备外酶。1．1．4．12004型恒温水浴锅(江苏国华有限公司)目前的研究热点多集中在从米曲霉中提取氨1．1．4．2生化培养箱(广东医疗器械厂)基酰化酶及该酶的固定化上，但其酶活力有待提高。1．1．4．3高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)我们对米曲霉所产生的氨基酰化酶的最佳活1．1．4．4净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)力条件进行了研究，通过在不同的反应时间，

5、反应1．1．4．518立升不锈钢手提式灭菌锅(上海申安)温度，缓冲液种类及pH条件下测定氨基酰化酶1．1．4．6立式压力蒸汽灭菌锅(上海华线医用核子的活力，得出氨基酰化酶的最佳活力条件，这对有仪器有限公司)关后续研究及应用具有重要作用。1．1-4．7可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)1材料与方法1．1．4．8电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司)1．1材料1．1．4．9分析天平(上海精密科学仪器有限公司)1．1．1供试菌株：米曲霉，由湖南机电专业技术学l⋯14．10移液枪(上海芬兰雷勃集团)麓第39卷第1期2010

6、年1月发酵科技通讯1．1．4．1l器皿：25OmL三角瓶，茄子瓶，移液管，计的无菌过滤装置过滤，得到均匀的米曲霉孢子试管，容量瓶，量筒。悬液，这一步要在无菌操作工作台上操作。1．1．4．12过滤器：自制。1．2_3．2固体发酵培养基灭菌冷却后分别接入1．2方法5ml孢子悬液，于30℃培养48h。l-2．1L一氨基酸的测定：1．2_4氨基酰化酶活性测定1．2．1．1茚三酮溶液：称取1．2g重结晶的茚三酮，1．2．4．1酶液制备：发酵结束后，称取lg固体曲，加15ml正丙醇，摇动使其溶解，然后加入2Oml正加10ml生理盐

7、水，浸提lh(搅拌)，然后采用两层丁醇，60ml乙二醇，混匀，再加入9mlpH4·54的醋纱布过滤，要将纱布上残余的液体挤干，取其滤液酸缓冲液，仔细混匀，保存于棕色瓶中，置于冷凉离心10min(6000rpm)，然后取其上清夜稀释1000处，试剂适用期限为10d。倍，测定酶活力。1．2．1．24tool／1醋酸缓冲液(pH4．5)：称取54．5g醋1．2．4．2酶活力测定：取0．2ml底物(0．2mol／LN一酸钠(CH3COONa·3Hz0)于烧杯中，加100ml蒸馏水乙酰一DL～丙氨酸)和0．6mlpH值7．0的磷

8、酸缓冲溶解，将烧杯置于电炉上，加热至沸，使溶液蒸发液于试管中，加入适当稀释的酶液0．2ml，37oC保至原体积的一半，冷至室温，加30ml冰醋酸，用无温30min(~H塞子)。采用茚三酮显色法测定水解产氨水稀释至100ml。生的L一丙氨酸，为了消除所用试剂和酶液中本身1．2．1．3氨基酸标准液：称取在80℃～90℃下烘所带有的氨基