基于氨基酰化酶产生菌米曲霉发酵条件的优化

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1、分类号:学校代码:10128UDC:学号:20071152硕士学位论文（类别:全日制硕士研究生题目：氨基酰化酶产生菌米曲霉发酵条件的优化英文题目：OptimizationofFermentationconditionofAspergillusOryzaeproducingAminoacylase研究生：王霞学科名称：化学工艺指导教师：刘丽华副教授二○一○年六月摘要氨基酰化酶具有光学异构专一性，能够选择性地水解N-酰基-DL-氨基酸，通过分离即可得到光学纯L-或D-氨基酸。工业上利用这一特点可以大规模生产氨基酸。因此，高活力和高立体选择性的氨

2、基酰化酶的生产菌株的选育和产酶条件的优化，是高效、低成本制备氨基酸的基础。现在用于氨基酸拆分的氨基酰化酶大多来自米曲霉发酵，但是其产量和质量远不能满足工业生产的需求。为解决这一矛盾，本论文以经过离子诱变的米曲霉为实验对象，通过改变它的碳源、氮源、磷酸盐、以及它们的浓度、装液量、温度、转速等各种因素来寻求它的最优发酵条件，以达到发酵条件的最优化。探求从外界环境进一步提高米曲霉产氨基酰化酶的酶活，为工业化，规模化生产奠定基础。实验通过单因素试验研究了碳源及浓度，氮源及浓度，磷酸盐及浓度、镁离子浓度，底物及表面活性剂等培养基添加物对氨基酰化酶生产

3、的影响，以及温度、接种量、装液量和转速等发酵条件对产酶的影响。结果表明发酵最适碳源为麸皮，最适氮源为有机复合氮源（蛋白胨和尿素），最适磷酸盐为磷酸二氢钠。实验结果表明，液态发酵的氨基酰化酶不是诱导酶，添加底物对酶活没有影响。而添加表面活性剂，对氨基酰化酶的活力有抑制作用。在单因素试验的基础上，利用正交设计法对主要因素进行9因素3水平试验，通过试验结果和方差分析确定优化培养基为：麸皮1%，蛋白胨1.25%，尿素0.75%，硫酸镁0.15%，磷酸二氢钠0.2%，不添加底物和表面活性剂。优化培养条件为：250ml三角瓶中装入20ml培养基，转速为

4、150r/min，接种量为8%，pH为6.5，不添加玻璃珠，40℃下，培养50h。以此培养基发酵3批样品，米曲霉产氨基酰化酶的平均酶活可高达850µmol/g•h。与优化前75µmol/g•h相比，酶活提高11倍多。另外，对诱变前后米曲氨基酰化酶蛋白的提取及结构进行了初步的探索。由于实验时间比较短，实验条件有限，蛋白酶提取效果并不好，需要今后继续努力研究，以便能得到较纯的氨基酰化酶。关键词：米曲霉；氨基酰化酶；培养条件；正交试验AbstractAminoacylasewithspecificopticalisomercanselective

5、lyhydrolyzeN-acyl-DL-aminoacids,opticallypureL-orD-aminoacidscanbeobtainedthroughseparation.Thespecificfeaturecanbeutilizedtoproducelarge-scaleproductionofaminoacidinindustrial.Therefore,aminoacylaseproductionstrainsselectionandoptimizationoffermentationconditionswithhighe

6、nergyandhighstereoselectivityishighlyefficient,low-costbasisforpreparationofaminoacids.NowaminoacylasethatsplitaminoacidsismostlyproductedbyAspergillusoryzaefermentation,buttheyieldandqualitycannotmeettheneedsofindustrialproduction.Tosolvethisproblem,theionmutationstrainso

7、fAspergillusoryzaewasusedastheexperimentalobjectinthisthesis,whichwerefermentbychangingcarbonsource,nitrogensource,phosphate,liquidvolume,temperature,rotatespeedandotherfactorstofindtheoptimalfermentationconditions.SeektofurtherimproveAspergillusoryzaeaminoacylaseenzymeact

8、ivityfromtheexternalenvironment,asindustrializationandmassproductionbasis.Bysinglefactort