黄鳍鲷骨骼肌伴肌动蛋白的纯化及其抗体制备

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1、第32卷第3期水产学报V01．32，NO．32008年5月JOURNALoFFISHERIESOFCHINAMay，2008文章编号：1000—0615(2008)03—0464—07黄鳍鲷骨骼肌伴肌动蛋白的纯化及其抗体制备杜雪莉1’2，周利亘3，王锡昌2，熊何健1，苏文金1，曹敏杰1(1．集美大学生物工程学院，福建厦门361021；2．上海水产大学食品学院，上海200090；3．浙江省农业科学院食品加工研究所，浙江杭州+310021)摘要：采用SephaerylS-400凝胶过滤柱层析和电洗脱等纯化方法，首次从黄鳍鲷骨骼肌中分离纯化到伴肌动蛋白，并制备了特异性多克隆抗

2、体。多克隆抗体经ProteinA—Sepharose亲和层析柱纯化得到高纯度免疫球蛋白G(19G)。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、免疫斑点印迹(Dot．Blot)和免疫印迹(Western．Blot)等方法对纯化的伴肌动蛋白及其多克隆抗体进行分析鉴定，并研究了不同贮藏条件下伴肌动蛋白的变化情况。SDS．PAGE结果显示本研究从黄鳍鲷骨骼肌中分离纯化了高纯度伴肌动蛋白；Dot．Blot检测结果显示兔抗黄鳍鲷伴肌动蛋白多克隆抗体效价为5×104；Western。blot检测表明兔抗黄鳍鲷伴肌动蛋白多克隆抗体能与肌原纤维蛋白中的伴肌动蛋白发生特异性反应，而与其它

3、蛋白不发生免疫交叉反应。关键词：黄鳍鲷；伴肌动蛋白；纯化；抗体中图分类号：Q512文献标识码：A伴肌动蛋白(Nebulin)是存在于肌原纤维肌肌动蛋白在鱼体肌肉弹性的形成及品质变化过小节中的一种大分子量蛋白，分子量约为500程中的作用具有较高的研究价值。最近，900kuE¨，也有文献报道约为800ku[2]，占肌原纤Mitsuhashi等Ll妇研究了鲭鱼在4℃贮藏条件下维蛋白总量的3％左右。Wang等[2]在研究脊椎肌联蛋白和伴肌动蛋白的变化发现，即使贮藏至动物骨骼肌大分子量蛋白时发现，除了肌联蛋白第7天，仍有50％左右的肌联蛋白未被降解，提和肌球蛋白重链以外，还有一种

4、大分子量的肌原示该蛋白良好的稳定性。相反，在同样贮藏条件纤维蛋白，它与肌联蛋白和肌球蛋白重链在免疫下，伴肌动蛋白至第4天几乎完全被降解。因此化学性质上有一定区别，最初将其命名为推测，伴肌动蛋白的降解与鱼体死后弹性变化有“band3”。在随后的研究中，该蛋白被命名为伴直接关系。肌动蛋白。伴肌动蛋白自z线向骨骼肌N末端黄鳍鲷(Sparuslatus)，属鲈形目细丝自由延伸，跟N末端细丝连接或是部分连(Percoiformes)鲷科(Sparide)，广泛分布于红接[3。]。伴肌动蛋白在肌原纤维结构中起“分子海、阿拉伯海、印度、日本、朝鲜、印度尼西亚、菲标尺”的作用[5。9]

5、，调节参与组装细丝的肌动蛋律宾的近海及我同广东、福建和台湾等省近海，白单体的数量。伴肌动蛋白与肌联蛋白(Titin)是我国海水养殖的重要经济鱼类之一。本文以共同形成肌原纤维周围的柔性丝状网。海水黄鳍鲷为研究对象，旨在从其肌肉中分离纯迄今为止，仅有Wang等Ei03从兔的背肌中利化伴肌动蛋白并制备高特异性多克隆抗体，为进用SDS加热处理、凝胶过滤等方法得到变性的伴一步研究该蛋白在鱼类保鲜贮藏过程中的分解肌动蛋白。作为高分子量肌原纤维结构蛋白，伴变化提供参考。收稿日期：2007—07．05资助项目：国家自然科学基金(30571450)；福建省自然科学基金(2006J0418

6、)；集美大学中青年创新团队基金(2006A002)作者简介：杜雪莉(1978一)，女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事食品生物化学与营养卫生等研究。通讯作者：曹敏杰，Tel：0592—6180378，E-mail：mjcao@jmu．edu．cn3期杜雪莉，等：黄鳍鲷骨骼肌伴肌动蛋白的纯化及其抗体制备465L’1Tris．HCl、3％SDS、5mmol·L。1EGTA、401材料与方法mmol·L一1DTr、2mmol·L～PMSF，pH8．0)1．1材料与试剂中，搅拌20rain后，离心，收集上清。体重200g左右的鲜活养殖黄鳍鲷购自集美取上述制备的上清液7．5mL

7、上样于用缓冲菜市场，即杀后取背部肌肉，立即使用或冻存于液(40mmol·L～Tris．HCI、0．1％SDS、一70℃冰箱待用。免疫动物为健康雄性纯种新20mmol·L1乙酸钠、5mmol·L’1EGTA、西兰大白兔，体重约2kg。购自厦门大学医学院1mmol·L～DTT，pH8．0)平衡的Sephacryl实验动物中心。S．400(1．5×98cm)凝胶过滤柱，用相同缓冲液SephacrylS-400和ProteinASepharose从洗脱，每管收集1mL。测定蛋白质的气∞值并进AmershamBiosciences公司购得；辣根过氧