重组人血管内皮抑素联合放疗治疗局部进展期直肠癌的研究.pdf

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1、分类号：R735密级：公开学校代码：11065学号：y0115130141专业博士学位论文重组人血管内皮抑素联合放疗治疗局部进展期直肠癌的研究作者姓名张克指导教师马学真主任医师专业领域肿瘤学培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月19日重组人血管内皮抑素联合放疗治疗局部进展期直肠癌的研究摘要目的：观察重组人血管内皮抑素联合放疗在乏氧条件下对结直肠癌细胞株HCT-116的放射敏感性；研究“时间窗”内应用重组人血管内皮抑素联合放疗对结直肠癌细胞株HCT-116裸鼠移植瘤的抑制作用及可能的作用机制；观察“时间窗”内使用重组人血管内皮抑素联合同步放化疗治疗局

2、部进展期直肠癌患者的临床疗效和毒副反应，外周血VEGF、CECs及aCECs治疗前后的变化是否与重组人血管内皮抑素治疗疗效相关。方法：1.体外细胞实验，在常氧和乏氧条件下培养结直肠癌细胞HCT-116，乏氧模型为在培养的细胞中加入终浓度为150μmol/L的CoCl2溶液形成细胞乏氧。①将培养的HCT-116细胞分为6组，分别加入终浓度为500mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、10mg/L、5mg/L、0mg/L的重组人血管内皮抑素，每组设3个附孔。用CCK-8法得到重组人血管内皮抑素对HCT-116细胞株在常氧和乏氧条件下的生长抑制

3、率，根据所得数值绘制细胞生长曲线，HCT-116细胞在常氧和乏氧条件下的IC20通过细胞生长曲线得出。②将培养的HCT-116细胞分为4组，分别为常氧组、乏氧组、常氧加重组人血管内皮抑素组、乏氧加重组人血管内皮抑素组。加重组人血管内皮抑素组根据CCK-8实验确定的IC20值，常氧组加重组人血管内皮抑素的浓度为350mg/L，乏氧组加重组人血管内皮抑素的浓度为450mg/L。每组按照射剂量不同分为5个小组，放疗剂量分别为0、2、4、6、8Gy。用克隆形成实验检测重组人血管内皮抑素联合不同放疗剂量处理HCT-116细胞后在常氧和乏氧条件下的细胞存活分数，实验结

4、果重复3次后取平均值，通过单击多靶模型拟合细胞存活曲线，得出各治疗组的平均致死剂量D0、准域剂量Dq、照射2Gy时的细胞存活率SF2和放射增敏比SER值。③取对数生长期的HCT-116细胞按每孔1x106个细胞接种于六孔板中，分为4个组，对照组、放疗组、重组人血管内皮抑素组、重组人血管内皮抑素联合放疗组。重组人血管内皮抑素组和联合组加入含重组人血管内皮抑素的培养液，放疗组和联合组采用6MV-X线照射，剂量为2Gy。用流式细胞术检测重组人血管内皮抑素联合放疗处理HCT-116细胞后在常氧和乏氧条件下细胞凋亡情况。2.动物实验，取对数期生长的结直肠癌细胞HCT

5、-116，用0.4%的台盼蓝计数，活细胞数>95%，用无血清McCoy's5a培养基制成1×107个/200μl的细胞悬液。将细胞悬液200μl/只接种于40只裸鼠背部近头侧皮下，形成皮下移植瘤，待肿瘤长至308±56mm3时，随机分成4组（每组10只）：对照组（连续10d每天瘤周皮下注射0.9%氯I化钠溶液0.2ml）；重组人血管内皮抑素组（连续10d每天瘤周皮下注射0.2ml重组人血管内皮抑素（20mg/kg））；放疗组（连续10d每天瘤周皮下注射0.9%氯化钠溶液0.2ml；在治疗的第5天予单次外放疗，6MV-X线，6Gy）；联合组（连续10d每天瘤

6、周皮下注射0.2ml重组人血管内皮抑素（20mg/kg）；在治疗的第5天予单次外放疗，6MV-X线，6Gy）。观察记录各组裸鼠肿瘤体积变化，裸鼠的精神、饮食状况以及体重变化。第16天，断颈处死裸鼠，将裸鼠背部的肿瘤组织完整剥出，用免疫组化法检测肿瘤组织中CD31、VEGF和HIF-1α的表达，WesternBlot法从蛋白水平检测VEGF的表达。3.临床试验，入组经免疫组化检测HIF-1α为阳性证实处于乏氧状态的ⅡB-ⅢC期的初治直肠癌患者50例，随机分为两组，联合组25例患者采用重组人血管内皮抑素联合同步放化疗（放疗采用IMRT：总剂量45-50Gy，单

7、次剂量：1.8-2.0Gy，第5天开始，共5周；化疗采用单药卡培他滨：825mg/m2，每天2次，d5-18，d26-39；重组人血管内皮抑素：7.5mg/m2d1-14，d22-35）；对照组25例患者采用同步放化疗，观察“时间窗”内应用重组人血管内皮抑素治疗后两组患者的疗效和毒副反应；并检测两组患者治疗前后血液VEGF、CECs和aCECs变化。结果：1.体外实验①在常氧和乏氧培养下重组人血管内皮抑素均可以抑制HCT-116细胞的生长，表现为随着重组人血管内皮抑素浓度的升高及作用时间的延长，细胞生长抑制率升高，呈时间剂量依赖性，从细胞存活率曲线上获得常

8、氧和乏氧条件下IC20分别为362.12±3.29mg/L和458