三氧化二砷对悬浮球囊培养mcf-7乳腺癌细胞作用的研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTh,roleofarsenictrioxideMCF．7一cellsleroleo：tarsenlCtrioxideon7breastcancercesMCF’．1'●。culturedsuspensionmammosphereByhaiboWuSupervisor：Prof．LiuxingWangOncologyTheFirstAffiliatedHospitalMarch2013学位论文原创性声明IIIIIlUlIIIIIIIIIY2313661本

2、人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：易待日期：沙／3年5月功日f学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检

3、索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：凑咱：伍日期：沙，，；年5，月Ⅵ日摘要三氧化二砷对悬浮球囊培养MCF．7乳腺癌细胞作用的研究研究生：吴海波导师：王留兴郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州450052背景乳腺癌(Breastcancer)，是全世界发病率仅低于肺癌的最常见恶性肿瘤，已成为20"'59岁女性死亡的最主要原因。近年来乳腺癌的发病率在世界各国均处于上升趋势。乳腺癌易复发，且转移性晚期乳腺癌

4、治疗效果极差，并发症重、死亡率高。因此，这就要求人们更加深入的研究乳腺癌发生发展的分子机制以及探求针对乳腺癌更有效的化疗药物。肿瘤干细胞假说认为占非均一肿瘤细胞群中的很小一部分细胞驱使着肿瘤的生长，并增强化、放疗的抵抗。这种新理论为肿瘤的临床治疗提供了新的研究方向。传统的治疗措施可以根除肿瘤组织中的大部分细胞从而使肿块缩小，但仍然有一小部分细胞存活，其具有使肿瘤复发的潜能。这一小部分具有自我更新、无限增殖及分化潜能的细胞被称为肿瘤干细胞(Cancerstemcells，CSCs)。其主要分选方法为利用肿瘤干细胞的功能特性及肿瘤干细胞的表面分子标记物进行分选；培养方法

5、主要为无血清悬浮球囊培养法。这为肿瘤干细胞的进一步研究提供了技术支持。近年来，国内许多研究证实三氧化二砷(As203)对白血病、原发性肝癌等多种实体瘤具有较好的疗效。最近有研究表明PML在维持癌干细胞的休眠状态中发挥重要作用。陈竺等研究发现三氧化二砷可以通过直接作用于癌蛋白PML-RAR，使其降解从而根除白血病细胞。因此，研究和探讨三氧化二砷对乳腺癌干细胞的作用及其机制可能为三氧化二砷对乳腺癌的临床治疗提供新的理论依据。摘要目的1．探讨球囊培养富集MCF．7细胞系中乳腺癌干细胞的可行性，并通过流式细胞仪检测所获得CD44+CD24川0w乳腺癌干细胞的比例。2．通过检

6、测不同浓度As203对悬浮球囊培养MCF．7细胞的增殖抑制作用及对细胞周期的影响。3．为As203临床应用于治疗乳腺癌提供更多的理论依据。方法1．细胞贴壁培养MCF．7细胞用RPMI．1640培养基(含10％灭活胎牛血清)，在37℃、5％C02的细胞培养箱中常规培养。1．2d换液，3～4d传代。2．细胞悬浮培养收集贴壁培养的MCF．7细胞重悬于DMEM／F12培养基(含B27、20ng／mLhEGF、O．4％牛白蛋白和5ug／mL胰岛素)，于37。C、5％C02的细胞培养箱中悬浮培养，3．4d半量换液，7．10d传代。3．球囊中CD44+CD24胡0w细胞比例检测收

7、集无血清培养的微球囊，胰酶消化并机械吹打为单细胞悬液，用PBS重悬细胞，每管为1x106／100uL。设实验组和同型对照组。实验组加入CD44．FITC和CD24．PE的单克隆抗体，对照组加入相应的同型对照抗体，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次后用500ulPBS重悬，1h内上流式细胞仪检测，重复检测三次。4．球囊细胞存活率测定收集无血清培养的微球囊，胰酶消化并机械吹打为单细胞悬液，细胞计数以5x105／mL细胞浓度接种于超低粘附96孔板，每孔接种4uL，设对照组(未加药组)和实验组，每组设5个复孔，于37℃、5％C02的细胞培养箱中悬浮培养24h、48和