结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变位点的检测及诊断抗原的筛选.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015200548单位代码：10759石河子大学硕士学位论文结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变位点的检测及诊断抗原的筛选学位申请人姬祥指导教师陈创夫教授曹旭东副教授石峰副教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向动物基因工程所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2018年6月DetectionofDrugResistanceGeneMutationinClinicalIsolatesofMycobacteriumTuberculosisandScreeningo

2、fDiagnosticAntigensADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByJiXiang(Animalgeneticengineering)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-FuA.Prof.CaoXu-DongA.Prof.ShiFengJune,2018课题来源“十二五”国家

3、科技重大专项："艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治"课题名称：新疆结核分枝杆菌耐药性以及结核病潜伏感染者的快速鉴别诊断技术研究项目编号：2013ZX10003003-003中文摘要由结核分枝杆菌感染所诱发的各器官疾病统称为结核病。近年来因结核病在世界范围内的流行趋势上升和耐药结核病发病人数的增多，为结核病的防控带来新的困难。目前临床诊断中常用细菌学方法进行结核病诊断与菌株耐药性分析，由于细菌培养耗时长，不能及时提供相关诊断结果，因此寻找其他方法对结核病和耐药结核病准确快速地诊断迫在眉睫。目的：（1）调查结核病高发地

4、区喀什的结核分支杆菌临床分离株对常用抗结核药物的耐药情况。（2）探讨菌株对药物的耐药表型与耐药基因突变的关系，初步评价DNA测序和药敏试验结果的一致性，为耐药结核病的快速诊断提供依据。（3）初步研究多种结核杆菌的特异性蛋白在检测结核病抗体上的价值，为新诊断抗原的筛选提供思路。（4）筛选出富含T细胞表位的结核菌抗原，探讨它们在IGRAs中的潜在价值。方法：（1）对113株结核分枝杆菌临床分离株进行比例法药敏试验，获得菌株的耐药表型。（2）对各菌株5种药物的耐药基因扩增和测序，以药敏结果为参考，计算Kappa值判断两者

5、的一致性。（3）构建编码结核菌蛋白的重组质粒，进行表达与纯化；建立不同抗原检测结核病特异性抗体的间接ELISA方法，分析其在诊断结核病上的能效。（4）利用预测软件预测上述抗原的T细胞表位，将得分较高的抗原进行IGRAs，筛选出诱导IFN-γ高水平释放的刺激抗原；通过刺激抗原的组合进行IGRAs，结果与T-SPOT.TB进行比较，分析刺激抗原在IGRAs的价值。结果：（1）结核分枝杆菌临床分离株对RFP、INH、SM、EMB、OFX药物的总耐药率分别为4.4%、11.5%、8.8%、2.6%、3.5%，临床分离株的单

6、耐药率为66.7%，多耐药率为33.3%；与药敏结果相比，DNA测序在检测结核分枝杆菌临床分离株各药物耐药的Kappa值分别为1、0.955、0.721、0.796、1。（2）成功构建了18种蛋白的原核表达载体，并获得17种重组蛋白的纯化产物。确定了上述蛋白在检测IgM、IgG抗体中的最佳条件。CFP-10、PPE57、Rv3807在检测IgM抗体具有较高的诊断能效，曲线下面积在0.621~0.762之间，灵敏度在54.7%~59.3%之间，特异性在71.3%~90%之间；PPE57、Ag85B、CFP-10、Rv

7、0220、38kDa抗原在检测结核病IgG抗体的表现较为优异，灵敏度保持在65.1%~76.7%之间，特异性在78.1%~88.3%之间。（3）成功预测到12种表位得分较高的抗原，建立了检测人IFN-γ含量的双抗体夹心ELISA方法；Rv1987、Rv3807、PPE57、Rv0220、MPT64刺激原单独进行IGRAs时，与ESAT-6、CFP-10、TB7.7相比具有较高的相关性（r＞0.5，p＜0.01）；Rv1987+Rv3807、16kDa+Rv0220、MPT64+Rv1986和全部蛋白的组合方式刺激T

8、细胞释放的IFN-γ含量与对照组具有良好的相关性（r＞0.692，p＜0.01）；组合蛋白作为IGRAs刺激抗原检测结核病的灵敏度在62.5%~80%之间，特异性在33.3~75%之间。结论：（1）用DNA测序技术分析结核分枝杆菌RopB、KatG、InhA、RpsL、rrs、gyrA、embB基因，对判断相关药物耐药性具有较高的灵敏度和特异性，可为耐药结核