结核分枝杆菌血清学抗原的筛选及hsp16.3诊断结核病的研究

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1、分类号密级结核分枝杆菌血清学抗原的筛选及Hspl6．3诊断结核病的研究ScreeningofMycobacteriatuberculosisserologicalantigensanddiagnosisoftuberculosisusingHspl6．3指导教师姓名、职称袁佳薹数援湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一四年五月摘要嘲朔目的：利用免疫共沉淀．偶联质谱技术筛选和鉴定能被结核病患者血清免疫球蛋白G(IgG)特异识别的结核分枝杆菌抗原，以DNA重组技术表达筛选的血清学抗原热休克蛋白16．3(Hspl6．3)，酶联免疫吸附试验分析其诊断结核病的价值，

2、以期为结核病的血清学诊断提供科学依据。方法：(1)于罗氏培养基中培养结核分枝杆菌H37Rv标准菌4周，收集菌体，冰浴超声法提取结核分枝杆菌菌体抗原；饱和硫酸铵分级沉淀法提取结核病患者血清抗体IgG；免疫共沉淀技术筛选菌体抗原中的血清学抗原，SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳予以分离，免疫印迹技术验证抗原的免疫活性，串联质谱技术鉴定免疫印迹反应中的各阳性蛋白条带。(2)提取结核分枝杆菌基因组DNA；从GenBank中查找Hspl6．3的基因序列，设计引物；聚合酶链反应扩增该基因，克隆至pMDl8．T载体，菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证，亚克隆至pQE30表达载体，

3、菌落PCR和双酶切鉴定重组子。(3)大量诱导Hspl6．3表达，并予亲和层析纯化：免疫印迹分析Hspl6．3免疫学活性，酶联免疫吸附试验评价重组Hspl6．3诊断结核病的价值。结果：(1)经免疫共沉淀和电泳分离，在约16kDa处存在1条能被结核病患者血清IgG特异性识别的蛋白质条带，经串联质谱鉴定包括结核分枝杆菌Hspl6．3、糖基转移酶和铁调控Lsr2蛋白前体3种抗原；(2)从结核分枝杆菌基因组DNA中扩增出hspl6．3基因，克隆至T载体后，亚克隆至原核表达载体pQE30，构建了重组表达质T粒pQE30-hspl6．3；经IPTG诱导，重组蛋白Hspl

4、6．3获得表达，大小约16kDa。(3)亲和层析纯化获得Hspl6．3；免疫印迹分析显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性，ELISA分析其诊断结核病的灵敏度为80．3％，特异性为91．1％，阳性预测值为90．O％，阴性预测值为82．3％，诊断效率为85．7％，对38kDa蛋白抗体阴性的结核患者血清检出率为62．5％。结论：(1)免疫共沉淀技术成功筛选出能被结核病患者血清特异性识别的结核分枝杆菌抗原；(2)经DNA重组技术表达获得结核分枝杆菌抗原Hspl6．3；(3)重组抗原Hspl6．3具有较好的结核病诊断价值。关键词：结核分枝杆菌；免疫共沉淀；热休克蛋白1

5、6．3；酶联免疫吸附试验；诊断ABSTRACTObjective：TheaimofthisstudyistoscreenandidentifytheantigensofMycobacteriatuberculosisrecognizedspecificallybyseraIgGoftuberculosispatientsusingCO—immunoprecipitationcoupledmassspectrometry．TheserologicalantigenHspl6．3isexpressedbyrecombinantDNAtechnologyandt

6、hepurifiedproteinwasusedtodetecttuberculosisbyenzymelinkedimmunosorbentassay．Methods：(1)ThestandardstrainH37RvofMycobacteriatuberculosiswasculturedinL-JmediumforfourweeksfollowedbytheextrationofMycobacteriatuberculosisantigensusingicebathultrasound．Thecrudeantigensweredetectedusin

7、gBicinchoninicAcidmethod．TheseraIgGoftuberculosiswasextractedbyfractionalprecipitationwithsaturatedammoniumsulfate．TheserologicalantigenswerescreenedfromtheantigensofMycobacteriatuberculosisusingCO-immunoprecipitationwithIgGandwasidentifiedbytandemmassspectrometry．(2)Thegenehspl6．

8、3wasamplifiedfromMycobacteriumtub