青岛地区结核分枝杆菌临床分离株吡嗪酰胺耐药基因pnca检测

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1、中文摘要青岛地区结核分枝杆菌临床分离株吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测摘要目的了解青岛地区结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因突变的情况，研究其与耐吡嗪酰胺之间的关系，并探讨建立新的、快速、有效的基因检测方法。方法采集76橼结核分枝杆菌临床分离檬，进行痰液涂片染色检查，应用BACTEC一460培养系统做细菌培养和梯度药敏试验，根据GeneBank中结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因序列，利用DNAStar软件分别设计对应于结核分枝杆菌复合群保守序列IS6110及pncA基园序列的PCR引物，PCR扩增目的基因片段，以结核分枝杆菌H37Rv标准株作为对照，应用PCR一单链构象多态性(

2、SSCP)技术检测pncA基因的突变。结果76株结核分技杆菌临床分离袜，经直接涂片染色法检出20侧阳性；经BACTEC-460培养系统检测，44株对吡嗪酰胺敏感。耐药株32株，其中低耐药株24株，高耐药株8袜，总耐药率为42．1％(32／76)。76株均经PCR扩增出结核分枝杆菌复合群保守序列IS6110基因片段(245bp)，69株扩增出pncA基因的特异序列(254bp)，7株未检出pncA基因扩增产物，其中包括耐药栋5株，分别为低耐药株3株．高耐药株2株；敏感株2株。以结核分枝杆菌标准株H37Rv为对照，69株结棱分枝杆菌临床分离袜中，SSCP泳动异常者18株，其中耐药株13株，包括低耐

3、药株8株，高耐药株5株，耐药株的pncA基因突变率为48．1％(13／27)；敏感株5株其pncA基囡突变率为11．9％(5／42)。SSCP泳动正常者5l株，其中耐药株14株，包括低耐药株13株，高耐药株1株；敏感株37株。结论青岛地区结核分枝杆菌临床分离株耐吡嗪酰胺的主要分子机制之一为pncA基因的突变；PCR—SSCP技术可快速准确检测结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺基因pncA的突变，弥补常规药敏试验的不足。关键词分枝杆菌。结核jpncA基因；BACTEC培养方法；聚合酶链反应；单链构象多态性研究生：孙冰梅(病原生物学)导师：于红英文摘要DETECTI()NOFPYRAZINAMIDE—RESI

4、STANTGENEpncAINCI。INICALISOLATESOFMY—C()BACTERIUMTUBERCUI．OSISINQINGDAODISTRICTABSTRACTObjectiveToinvestigatethemutationsofpncAgeneinclinicalisolatesofMycobaeteriumtuberculosisandtherelationshipbetweenpneAgoneandpyrazinamide—resistancestrainsinQingdaodistrict，andtoprovidearapidandreliablemethodforde

5、tectinggenemutation，whichwillmakeuptheinadequatenessofroutinedrug—sensitivitytest．MethodsIn76clinicalisolatesofMycobacteriumtuberculosis，Mycobacteriumttl—berculosisweredirectlydetectedbysputumsmear，thedrugresistanceweredetectedbyBACTEC一460system．WiththeDNAStarsoftwares，tWOpairofPCRprimerswerecrea—te

6、dfromthewhoiesequeneesofH37RvstandardstraininGoneBank．onepairforcon—servedsequenceofIS6110，theotherforpneAgene，andthetargetgeneswereamplifiedbyPCRtechnique．ThemutationsofpncAgeneweredetectedbyPCR-SSCP，with8posi—tirereferenceofMyeobacteriumtuberculosisH37Rvstrain．ResultsInthe76cliniealisolates，Z0stra

7、inswerepositivebysputumsmear．WiththeBACTEC·—460system44strainswerepyrazinamide—。sensitiveand32werepyrazinamide--resistant，whichincluding24lowpyrazinamide-resistantstrainsand8highpyrazinamide-resistant